苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

【目的】丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%~92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。     

苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表达及特性研究

【目的】从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca体内克隆葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOX)基因cDNA序列,并进行原核表达及活性测定。同时对GOX在不同组织的特异表达及对葡萄糖诱导反应的特性进行研究。【方法】以苜蓿夜蛾为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术,扩增苜蓿夜蛾GOX基因全长cDNA序列。利用原核表达载体p ET-21b在大肠杆菌中表达苜蓿夜蛾的GOX基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化,再利用梯度透析法进行复性,以葡萄糖为底物进行酶的活性测定。同时利用Real-time PCR分析GOX的组织特异性表达和对葡萄糖的诱导反应。【结果】该cDNA序列有2 154个碱基,开放阅读框1 824个碱基,编码607个氨基酸组成的多肽,分子量为67.04 ku,多肽的等电点为5.13。该序列命名为Hv GOX,在Gen Bank的登录号为KT907054。序列分析表明,Hv GOX的氨基酸序列与其他昆虫的GOX氨基酸序列高度同源。该基因在大肠杆菌表达系统中成功地进行了诱导表达,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。由原核表达载体表达后的蛋白经过变性、纯化和复性后有活性。Real-time PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾的不同组织均有m RNA水平的特异表达,其中在唾腺中的表达量最高;同时用0.01%、0.1%、1%和10%葡萄糖溶液浸泡的大豆叶喂食的幼虫,幼虫体内的GOX的表达均被诱导,且在10%的浓度时诱导表达量最高。【结论】本研究在苜蓿夜蛾体内获得一个新的葡萄糖氧化酶基因,该结果为进一步研究葡萄糖氧化酶在昆虫体内的生物功能奠定基础。     

华北大黑鳃金龟中肠丝氨酸蛋白酶cDNA克隆、 序列分析及表达

丝氨酸蛋白酶是昆虫体内一类重要的消化酶, 为了了解该类酶的分子特性及功能, 本研究利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库, 首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列, 命名为HoSP1（GenBank登录号为FJ573146）。序列分析表明, 该基因长902 bp, 开放阅读框（ORF）长783 bp, 编码260个氨基酸, 推测分子量和pI值分别为26.7 kDa和4.19, 不含有N-糖基化位点, 但在Thr₁₅₇处有一个O-糖基化位点, 含有6个保守的半胱氨酸残基, 组成3对二硫键, 对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现, 该酶具有组氨酸（His）、 天冬氨酸（Asp）、 丝氨酸（Ser）催化中心, 与褐新西兰肋翅鳃金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性, 其中与CzSP3的序列一致性最高, 为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后, 进行体外表达, 以BTEE为底物, 测得该酶的活力为0.0378 μmol/mg·min。HoSP1基因的克隆及体外表达为进一步研究该酶在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能提供了依据。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

烟实夜蛾信息素结合蛋白3 cDNA的克隆、序列分析与原核表达

利用RT-PCR技术从烟实夜蛾Helicoverpa assulta (Hass) 雄虫触角中扩增得到了信息素结合蛋白3(Hass PBP3)。克隆和测序结果表明,该基因核苷酸序列全长495 bp,编码164个氨基酸残基,预测分子量18.5 kD。并预测N-末端疏水区包含由22个氨基酸组成的信号肽。因此,成熟蛋白应包括142个氨基酸,预测分子量为16.1 kD,等电点为5.44。经氨基酸序列同源性分析发现,此序列与已知昆虫PBP3有较高的同源性,而且具有气味结合蛋白的典型特征。将该基因重组到表达载体pGEX-4T-2中进行原核表达。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析和Western印迹检测,结果表明烟实夜蛾PBP3基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约42 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员.本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyx mori serpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础.首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经...     

丝氨酸蛋白酶的重组表达

丝氨酸蛋白酶是蛋白酶家族中的一大家族 ,广泛分布于细菌、病毒、真菌、植物、动物中 ,并参与生命的各种反应。随着丝氨酸蛋白酶研究的深入 ,重组表达获得大量的目的蛋白酶已成为研究该类蛋白酶的一大基础技术。本文重点综述了丝氨酸蛋白酶在不同表达系统中重组表达的优缺点及最新进展。     

Wistar大鼠Pdia3cDNA的克隆及原核表达

哺乳动物的精卵融合是一个多分子参与的复杂过程,目前只鉴定出几种影响精卵融合的蛋白因子,对其分子机制还知之甚少.其中位于精子上的Pdja3具有二硫键异构酶活性,可能催化其他精卵融合相关蛋白的二硫键变化而参与精卵膜融合.克隆了Wistar大鼠的Pdia3 cDNA片段,长度为1 620 bp,其中编码区为1 518 bp.测序结果显示,编码区内有两个碱基与GenBank公布的大鼠Pdia3cDNA不同,分别为第147个密码子GAG(Glu)的第1位碱基和第410个密码子AAG(Lys)的第3位碱基,前者造成氨基酸替换,后者仅为多态性.此外,还在大肠杆菌中成功地表达并纯化了GST-Pdia3融合蛋白,为下一步研究大鼠Pdia3在体外影响精卵融合和与其它蛋白的相互作用奠定了基础.     

烟实夜蛾触角化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术扩增了编码烟实夜蛾 Helicoverpa assulta 触角化学感受蛋白（chemosensory protein）的全长cDNA。克隆和测序结果表明,烟实夜蛾化学感受蛋白基因核苷酸序列全长384 bp(GenBank序列号： DQ285667),编码127个氨基酸残基,预测N-末端包含16个氨基酸组成的信号肽序列,因此估测其成熟蛋白分子量为12.97 kD,等电点为5.32。将该基因重组到表达载体pGEX-4T₂中,并转入原核细胞中进行表达。SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导后,烟实夜蛾化学感受蛋白基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条约39 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和We...     

梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在化学感受系统中的作用, 本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列, 命名为GmolCSP （GenBank 登录号： JQ821389）。序列分析表明, GmolCSP开放阅读框序列为384 bp, 编码127个氨基酸残基, 预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列, 其成熟蛋白的预测分子量为12.80 kD, 等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示, GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、 去触角的头、 胸、 腹、 足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE和Western 印迹检测结果显示, 梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29 kD的融合蛋白, 与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。     

小菜蛾中肠氨肽酶基因PxAPN5的克隆、原核表达及蛋白质同源建模分析

【目的】克隆和表达小菜蛾Plutella xylostella氨肽酶基因,并进行基因序列分析和同源建模分析。【方法】以小菜蛾中肠cDNA为模板克隆分析氨肽酶基因序列, 原核表达氨肽酶蛋白并进行酶活性测定, 应用配体印迹分析氨肽酶与Cry2Ab蛋白的结合, 通过蛋白质建模对突变位点进行分析。【结果】从小菜蛾中肠cDNA 扩增出氨肽酶基因, 该基因全长2 853 bp, 编码950个氨基酸, 预测蛋白分子量为107.3871 kDa, 等电点为5.24; 进化树分析显示, 克隆得到的氨肽酶基因属于APN家族5, 将其命名为PxAPN5（GenBank登录号: KM034756）。PxAPN5蛋白具有鳞翅目昆虫氨肽酶蛋白的保守性特征, 即含有N-糖基化位点、O-糖基化位点和GPI锚定位点, 具有“HEXXH”锌蛋白酶结构域和C端跨膜区域。在大肠杆菌Escherichia coli中原核表达PxAPN5, 表达产物经SDS-PAGE电泳, 在110 kDa附近出现特异性条带; 酶活性测试显示菌体破碎上清液具有氨肽酶活性, 比活力为1 047.2 U/g。配体印迹结果显示表达的PxAPN5能与Cry2Ab蛋白特异性结合。多序列比对结果表明, 与其他已报道的小菜蛾氨肽酶相比, PxAPN5氨基酸序列有3个保守性位点发生了突变,并通过蛋白质建模的方式表征突变位点。【结论】本研究成功克隆和表达了具有氨肽酶活性的小菜蛾氨肽酶, 并发现其能与Cry2Ab蛋白特异性结合; 通过蛋白质建模对氨肽酶突变位点的特征及功能进行了预测。 这些结果对小菜蛾氨肽酶的功能性研究提供了理论基础。     

叉角厉蝽丝氨酸蛋白酶及抑制剂基因的克隆与表达分析

为明确叉角厉蝽Eocanthecona furcellata (Wolff)丝氨酸蛋白酶基因EfSP1及抑制剂基因EfSPI20的基因序列特征和时空转录特征,为其生理功能研究奠定基础。利用PCR克隆技术获得叉角厉蝽唾液腺EfSPI20和EfSP1的完整开放阅读框(Open reading frame, ORF)序列,使用生物信息学软件进行序列分析以及系统进化分析,采用实时荧光定量PCR (Real time quantitativate PCR,RT-qPCR)分析两个基因分别在叉角厉蝽不同发育时期和组织中的表达特征。结果表明,EfSPI20与EfSP1基因完整开放阅读框长度分别为378 bp和921 bp,分别编码125个氨基酸和306个氨基酸,预测均为亲水蛋白质,理论分子量分别为13.48 kDa和33.82 kDa,等电点分别为6.68和5.80,分别有30个和23个氨基酸残基的信号肽序列,EfSPI20有跨膜结构域,EfSP1无跨膜结构域。序列比对显示叉角厉蝽EfSPI20与茶翅蝽Halyomorpha halys PPI同源性最高,氨基酸序列一致性达58%;EfSP1与稻绿蝽Nezara viridula SP同源性最高,氨基酸序列一致性达66%;系统发育树显示叉角厉蝽与同为蝽科的茶翅蝽和稻绿蝽物种亲缘关系近。EfSPI20基因在雌雄成虫和唾液腺中高表达,推测EfSPI20可能具有抑制胰蛋白酶活性的功能和与叉角厉蝽的捕食消化相关;EfSP1基因在卵期、卵巢和肠道中高表达,推测EfSP1可能与叉角厉蝽的生殖功能和蛋白消化相关。     

烟实夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的克隆、序列分析与表达

应用RT-PCR技术,从烟实夜蛾Helicoverpa assulta幼虫脂肪体组织和血细胞总RNA中反转录扩增脂肪酸结合蛋白(fatty-acid binding protein,FABP)基因的cDNA片段,克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达并进行检测。结果表明：扩增得到的片段全长399 bp(GenBank登录号为DQ299942),编码132个氨基酸残基,预测分子量15.0 kD,等点电5.83。FABP融合了GST。原核表达后经电泳检测到约41 kD大小的外源蛋白,Western blot检测表明是目的蛋白。