用Fura-2测定缺氧时海马细胞内游离钙离子浓度的变化

本文用Fura-2荧光测定技术直接监测了缺氧时大鼠海马细胞内游离钙离子浓度[Ca~(2+)]_1的变化。实验发现,缺氧可使海马细胞[Ca~(2+)]_1显著增高,并且在缺氧过程中其增高呈现明显的时相性变化。在去除细胞外钙的情况下,缺氧仍能使[Ca~(2+)]_1增高,仅增高幅度有所降低;另外[Ca~(2+)]_1不再出现时相性变化特征。结果提示,胞外Ca~(2+)的内流以及内源Ca~(2+)的释放均参与了缺氧所致海马细胞[Ca~(2+)]_1的增高过程,缺氧时[Ca~(2+)]_1升高的时相性变化为胞外Ca~(2+)内流引起。     

NADPH氧化酶在1-戊烯-3-酮诱导的拟南芥早期信号事件中的作用

1-戊烯-3-酮(1-penten-3-one)作为重要的植物挥发性信号物质可诱导拟南芥防御反应早期信号的产生。但是拟南芥叶肉细胞响应1-戊烯-3-酮早期信号转导途径尚未见到报道。本研究以拟南芥为材料,研究了NADPH氧化酶对1-戊烯-3-酮处理后拟南芥早期信号的作用。实验采用非损伤微测技术结合激光共聚焦技术探究了1-戊烯-3-酮诱导的活性氧(ROS)、跨膜离子流信号与NADPH氧化酶之间的关系,结果表明:1-戊烯-3-酮处理能够诱导拟南芥叶肉细胞H_2O_2含量增加、Ca~(2+)外排和H+内流等早期信号事件,NADPH氧化酶抑制剂二联苯碘(DPI)处理后1-戊烯-3-酮诱导的拟南芥叶肉细胞Ca~(2+)外排减弱,胞内钙库抑制剂钌红处理后1-戊烯-3-酮诱导的拟南芥叶肉细胞H+内流减弱,说明1-戊烯-3-酮通过激活NADPH氧化酶诱导了拟南芥叶肉细胞H_2O_2产生,胞内H_2O_2的积累可能通过激活胞内钙库引起细胞内Ca~(2+)浓度增加,进而引起Ca~(2+)的外排和H+的内流。     

Con A刺激致T淋巴细胞胞浆游离Ca~(2+)浓度升高

本文分别应用荧光Ca~(2+)指示剂Quin2和Indo-1研究了Con A刺激的T淋巴细胞[Ca~(2+)]i升高过程及其发生机制.结果表明Con A与T淋巴细胞作用可导致细胞[Ca~(2+)]i的迅速升高.这种增加的胞内游离Ca~(2+)不仅来自胞外Ca~(2+)的内流,也来源于胞内钙库的释放.其中Ca~(2+)内流与T细胞钙通道的开放有关.可被钙通道抑制剂戊脉胺抑制,细胞的去极化及钾通道阻断剂四乙胺均不能阻断Ca~(2+)的内流,提示Ca~(2+)内流不是通过电位操纵的钙通道实现的,也与拥通道的开闭无关.Ca~(2+)内流可能是通过Con A受体活化的受体操纵的钙通道而实现的.     

跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~3+-ATP酶调节的特异性

我们曾报道跨膜Ca~(2+)梯度可通过膜脂影响肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的构象和活性。本文就跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的调节是否具有特异性作进一步研究。结果表明这种特异性表现在两方面:一是跨膜Ca~(2+)梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶功能的调节不能归结于跨膜Ca~(2+)浓度梯度所导致的膜电位的作用,离子载体FCCP 可消除跨膜电位但并不影响肌质网Ca~(2+)-ATP 酶的活力;二是其它二价金属离子如Sr~(2+)的跨膜梯度对肌质网Ca~(2+)-ATP 酶活力基本无影响。荧光偏振系列探剂n-AS 测定的结果表明跨膜Ca~(2+)与Sr~(2+)梯度对嵌有Ca~(2+)-ATP 酶的脂酶体的中部流动性的影响有较大差异。而Ca~(2+)-ATP 酶的Ca~(2+)结合位点正处于脂双层中部,这进一步提示膜脂参与了跨膜Ca~(2+)梯度对Ca~(2+)-ATP 酶的调节作用。     

钙通道与钙释放通道

1.Ca~(2+)的重要生理作用胞内游离钙浓度([Ca~(2+)])的变化调节着细胞的代谢、基因表达等细胞共有的活动,以及始动兴奋、收缩或出胞分泌以及激活和失活离子通道等细胞不同的反应。[Ca~(2+)]的升高主要依赖于胞外钙经质膜上的钙通道内流或/和胞内储存钙的释放。释放的内钙也是藉细胞器膜的钙释放通道进入胞浆。可见通道启闭活动的正常是维持[Ca~(2+)]正常的一个重要保证。2.离子通道及其分类离子通道是贯穿于质膜或细胞器膜的大分子蛋白质,其中央形成能通过离子的亲水性孔道(pores)。离子的跨膜转运是通过膜上通道蛋白的功能来完     

大鼠海马脑片缺氧诱导Ca~(2 )/CaM PKII活性抑制机理的研究

采用大鼠海马脑片体外缺氧模型,观察了Ca2 和氯胺酮对海马脑片Ca2 ／CaMPKⅡ活性的影响,同时观察了缺氧对神经元胞外谷氨酸堆积的影响。结果如下：（1）有钙或无钙培养时,酶活性随缺氧时间的延长均下降,但前者比后者酶活性下降更显著,提示外ca2 在神经元缺氧损伤中起重要作用。（2）海马脑片在体外缺氧30min,谷氨酸在胞外的堆积增加2倍多。（3）单纯过量外源性谷氨酸能引起酶活性显著下降,提示脑缺氧时酶活性的抑制与兴奋毒性有关。（4）氯胺酮对缺氧和单纯外源性谷氨酸所诱导的酶活性抑制均有明显的拮抗作用,说明脑缺氧引起酶活性下降与NMDA受体介导有关。我们的结论是：脑缺氧时该酶活性的抑制是与下列途径有关：谷氨酸→NMDA受体→Ca2 →Ca2 靶酶。     

海马神经元ROS和Ca2+对极低频电磁场实时响应的方法研究

现有极低频电磁场(extremely low frequency-electromagnetic fields,ELF-EMFs)生物效应的研究方法是非实时组间对照,这种方法无法排除细胞对电磁场反应个体敏感性的差异,以及实验过程中条件变化的差异.本文提出一种对同一个细胞在同一条件下的前后对照实时观察ELF-EMFs反应的方法.采用稳定域鉴别ELF-EMFs暴露前海马神经元的稳定性,在电磁场加入时刻(t=60 s)分别用0、0.09、0.38、0.76、7.33、14.78 mT的ELF-EMFs作用于海马神经元,实时记录海马神经元活性氧(reactive oxygen species,ROS)和Ca~(2+)荧光响应曲线,建立ELF-EMFs与ROS和Ca~(2+)的自相关函数.结果表明:a.在ROS暴发时间和Ca~(2+)暴发时间,ROS和Ca~(2+)荧光响应具有阶跃性,这是判断实时响应的重要标志;b. ROS和Ca~(2+)对ELF-EMFs响应时间具有延时性,并且不一致;c. ROS和Ca~(2+)对ELF-EMFs实时响应具有剂量性;d.海马神经元ROS对ELF-EMFs响应具有复杂性;e.海马神经元Ca~(2+)对电磁场响应主要是渐进稳定.当ELF-EMFs与ROS和Ca~(2+)实时响应的相关函数大于0.3可以判定具有相关性.由此得出,一种ELF-EMFs暴露下细胞ROS和胞内Ca~(2+)的实时响应方法对电磁生物效应评价是可行的.     

5—羟色胺抑制谷氨酸对海马神经元的毒性作用

为探讨5-羟色胺（5-HT）对过量谷氨酸（glutamate,Glu)神经毒性的影响。观察了5-HT存在时,过量Glu对海马细胞存活率、海马脑片CA1区群锋电位（population spike,PS)及神经细胞膜Ga^2 电流的影响。结果发现：5-HT可明显提高过量Glu作用下海马神经细胞的存活率,减缓Glu对海马脑片CA1区PS的降低作用;在细胞膜上,5-HT可明显减弱Glu诱导的Ca^2 内向电流,推测,一定浓度的5-HT具有抑制过量Glu神经毒性的作用。在细胞膜上5-HT可明显减弱Glu诱导的Ca^2 内向电流,推测,一定浓度的5-HT具有抑制过量Glu神经毒性的作用,其机制可能在于5-HT与细胞膜上特定的受体结合,抑制了Glu诱导的Ca^2 内流。     

大鼠海马神经元膜离子通道随培养时间变化的特点

目的和方法:采用膜片钳全细胞记录技术观察新生大鼠海马神经元体外分散培养过程中,基本离子通道和膜参数随培养天数延长而变化的规律.结果:在7 d,14 d和21 d时电压依赖性钠电流(Voltage-dependent Na cur-rent,ⅠNa)和延迟整流性钾电流(Delayed rectifier K current,Ⅰk)的幅度无显著性差异.电压依赖性钙电流(Voltage-dependent Ca2 current,ⅠCa)和ⅠCa密度则持续增大,进一步研究表明,L型钙通道(L-type voltage-dependent Ca2 channel,L-VDCC)的增加是其主要原因.NMDA诱发电流随培养时间延长而明显增加.结论:钙通道和NMDA受体所介导的Ca2 内流是神经元易感于衰老和死亡的重要机制之一.     

大麦根细胞质膜Ca~(2+)-ATP酶和Ca~(2+)转运系统的特性

用大麦质膜微囊研究细胞质膜 Ca~(2+)转运过程,发现质膜 Ca~(2+)—ATP酶在反应系统中不存在Mg~(2+)时可正常表现活性。跨膜Ca~(2+)转运按其对Mg~(2+)的需求可分为两个过程,一个是不需Mg~(2+)的、具高Ca~(2+)亲和力和较低的转运能力;另一个则是需Mg~(2+)的、具低Ca~(2+)亲和力和较高的转运能力。前者的动力学特征与Ca~(2+)—ATP酶相近,而后者则相差很大。据此推测,大麦根细胞质膜上除Ca~(2+)—ATP酶外,还存在另一个不同的Ca~(2+)转运系统。由两者分别承担的Ca~(2+)转运过程在细胞钙信使系统中可能起着不同的作用。     

血管紧张素Ⅱ增加新生鼠脑细胞胞浆Ca~(2+)浓度

本文应用荧光钙测定技术观察了血管紧张素Ⅱ(AⅡ)对新生Wistar鼠脑细胞胞浆Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)的影响。结果表明:血管紧张素Ⅱ在1nmol/L—1μmol/L浓度下可诱导新生鼠脑细胞[Ca~(2+)]_i增加,具量效关系。在无外Ca~(2+)存在对,其增加幅度有所减少。上述效应可被血管紧张素Ⅱ拮抗剂Saralasin所阻断,并呈剂量依赖关系。上述结果提示,血管紧张素Ⅱ可激活血管紧张素AⅡ受体,增加脑细胞[Ca~(2+)]_i,该效应通过细胞内Ca~(2+)释放和细胞外Ca~(2+)内流两条适径实现,前者的作用是主要的。     

Cu2+-Aβ 复合物与Aβ 单体诱导神经元 H2O2 释放作用的比较研究

目的:比较不同摩尔比Cu~(2+)-Aβ复合物与Aβ单体诱导神经元H_2O_2释放作用的差异。方法:制备不同摩尔比(0.1-5)的Cu~(2+)-Aβ复合物,通过检测硫磺素T(Thioflavin T,Th T)荧光强度考察Cu~(2+)对Aβ纤丝形成的影响。利用原代培养的大鼠海马神经元细胞,分别以不同摩尔比Cu~(2+)-Aβ复合物,不同浓度Cu~(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1),以及Aβ单体和Cu~(2+)处理细胞,检测培养上清中的H_2O_2含量;分离线粒体,分别检测不同浓度Cu~(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1),以及Aβ单体和Cu~(2+)处理后H_2O_2的释放;观察不同摩尔比Cu~(2+)-Aβ复合物,不同浓度Cu~(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1),以及Aβ单体和Cu~(2+)对神经元细胞活力的影响。结果:(1)Th T荧光试验结果表明,Cu~(2+)与Aβ(10μM)摩尔比为1~5范围内可明显抑制Aβ纤丝形成。(2)Cu~(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1~5;Aβ浓度为10μM)以及摩尔比为1的Cu~(2+)-Aβ复合物(Aβ浓度分别为5,10μM)可显著诱导神经元释放H_2O_2;另外,摩尔比为1时,Cu~(2+)-Aβ复合物还可诱导神经元线粒体内H_2O_2释放;上述作用均强于Aβ单体或Cu~(2+)。(3)Cu~(2+)-Aβ复合物(摩尔比为1~5)可显著降低神经元细胞活力,该作用强于Aβ单体或Cu~(2+)。结论:与Aβ单体相比,Cu~(2+)-Aβ复合物诱发神经元细胞及其线粒体释放H_2O_2作用更强,并诱发更为明显的神经元毒性。提示Cu~(2+)与Aβ之间的配位结合可能增强其引发活性氧释放以及神经元毒性反应;Cu~(2+)-Aβ复合物引发的活性氧可能主要来自线粒体。     

钙离子对心脏的反常作用

“钙离子反常作用”是在离体灌流的动物心脏先用无钙灌流液(除Ca~(2+)缺乏外其它成分均正常)灌流一定时间,继而恢复正常灌流时所观察到的一种严重心肌损害现象。该现象的发生可能是由于恢复正常灌流时Ca~(2+)的大量快速内流造成细胞Ca~(2+)过荷所致;而无钙灌流则使细胞膜超微结构和通透性发生变化,对Ca~(2+)通透性显著增高。     

在ts-RSV LA90细胞转化过程中钙流变化的研究

本文以ts-RSV LA90细胞为模型,用放射性同位素示踪技术测定了通过细胞质膜的~(45)Ca~(2+)流水平;同时用钙指示剂Indo-1 AM和光学多道分析仪测定了胞内[Ca~(2+)]_i,初步研究了Ca~(2+)流和[Ca~(2+)]_i在v-src基因引起细胞转化过程中的动态变化。结果表明LA90细胞质膜上~(45)Ca~(2+)流的改变是细胞转化过程中可以检测到的早期事件之一,转化状态(33℃)细胞的~(45)Ca~(2+)流大于正常状态(40℃)的,细胞从正常到转化(40℃→33℃)的25分钟内~(45)Ca~(2+)流就有明显增大。TMB-8可以抑制转化引起的~(45)Ca~(2+)流出的增大,小牛血清可以刺激正常状态细胞的~(45)Ca~(2+)流出增大,~(45)Ca~(2+)流出与温度有一定依赖关系;细胞转化引起的~(45)Ca~(2+)流入增大,可被异博定抑制,~(45)Ca~(2+)流入不受温度的影响。LA90细胞[Ca~(2+)]_i在转化早期有明显升高,并维持在较正常细胞高2—3倍的水平,A23187-Br可提高正常LA90细胞[Ca~(2+)]_i,[Ca~(2+)]_i不受温度的影响。从质膜上~(45)Ca~(2+)流和[Ca~(2+)]_i的增大说明转化细胞虽然对胞外Ca~(2+)浓度依赖性下降,但维持增殖及转化状态仍然需要一定的胞外Ca~(2+),并通过提高质膜Ca~(2+)流入和释放内源性Ca~(2+),使转化细胞[Ca~(2+)]_i维持在较高水平上。LA90细膜质膜上~(45)Ca~(2+)流和[Ca~(2+)]_i的增大在细胞转化中起着重大作用。     

强声暴露对巴马小型猪海马细胞内Ca~(2+)变化及其信号通道的影响

声音对神经系统有重要影响,本研究旨在探讨噪音或高强度声音刺激对神经系统的影响及其机制。将听力正常的巴马小型猪随机分为正常对照组与强声暴露组。强声暴露组的巴马小型猪暴露于中低频强声(900 Hz-142 dB SPL)环境中15min,暴露结束后即刻分离出海马组织。用Fluo-4探针观察海马组织细胞内Ca~(2+)浓度([Ca~(2+)]_i)的变化,用real-time PCR和Western blot分别检测Ca~(2+)受体、L-型Ca~(2+)通道α2/δ1亚基、PKC和PI3K的mRNA和蛋白表达,用DAPI染色法观察细胞核形态变化。结果显示,相对对照组,强声暴露组小型猪海马组织细胞[Ca~(2+)]_i明显增加,L-型Ca~(2+)通道α2/δ1亚基、PKC和PI3K mRNA表达上调,Ca~(2+)受体和PKC蛋白表达显著上调。此外,强声暴露引起海马组织细胞核出现肿胀变形等损伤样改变。以上结果提示,强声暴露可以通过激活海马组织PKC信号通路,引起[Ca~(2+)]_i上调,最终导致海马组织内细胞的损伤。本研究结果不仅揭示了强声引起神经损伤的可能机制,同时为防护强声对神经系统造成的损伤提供了新的思路。     

血管平滑肌细胞的钙动力学

血管平滑肌细胞外的Ca~(2+)通过多种通道进入细胞内。Ca~(2+)通道的本质是镶嵌在膜脂质双分子层中的糖蛋白,神经介质和药物可影响Ca~(2+)通道的功能。靠近胞膜的肌质网和胞膜内侧面的高亲和性Ca~(2+)结合位点是血管平滑肌细胞内储存和释放Ca~(2+)的主要部位。胞浆[Ca~(2+)]增高后在钙调蛋白的介导下引起血管收缩。高血压等血管性疾病的发生与其平滑肌细胞的钙动力学异常有关。     

丛枝菌根真菌根外菌丝跨膜H~+和Ca~(2+)流对干旱胁迫的响应

丛枝菌根真菌(AMF)能够和大多数陆地植物形成共生体系,对于植物生长发育和适应各种逆境胁迫具有重要作用。很多研究表明干旱胁迫下AMF能够促进宿主植物对水分的吸收从而增强植物抗旱能力,但目前针对AMF根外菌丝响应水分胁迫的生理变化以及AMF与宿主植物逆境信号交流的研究并不多。该研究利用AMF Rhizophagus irregularis和胡萝卜(Daucus carota var. sativa)毛状根双重无菌培养体系获得纯净根外菌丝,向培养基添加聚乙二醇(PEG)模拟干旱胁迫,运用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM-EDS)观察干旱胁迫对AMF根外菌丝形态的影响,同时采用非损伤微测技术(NMT)观测根外菌丝跨膜H+和Ca~(2+)离子流变化。结果发现,PEG处理1h后菌丝尖端和侧面发生H+外流和强烈的Ca~(2+)内流,荧光探针分析也显示菌丝胞内pH值显著上升、Ca~(2+)浓度增加; PEG处理24 h后菌丝形态发生明显变化,培养基pH值降低, P、Ca、Fe等元素在菌丝际积累。这些试验结果表明,干旱胁迫下AMF根外菌丝跨膜H+和Ca~(2+)流发生变化,促进了菌丝与环境之间的物质交换。菌丝酸化生长环境有利于养分吸收,并促进AMF与宿主植物之间的信号交流以增强植物的耐旱性。     

七氟醚对大鼠海马脑片缺血损伤的保护作用

目的:探讨七氟醚对脑缺血损伤的保护作用及其机制。方法:用电生理细胞外记录的方法和组织学检查的技术,观察对照组、2%七氟醚组和4%七氟醚组对缺氧无糖(OGD)及谷氨酸(Glu)损伤所致的大鼠海马脑片CA1区顺向群峰电位(OPS)的影响及各组脑片超微结构的变化。结果:对照组和2%七氟醚组在OGD和Glu损伤后海马脑片OPS很难恢复;4%七氟醚组明显改善OPS的恢复程度和恢复率,减轻海马CA1区神经元细胞损伤。电镜观察可见,对照组OGD和Glu损伤后海马CA1区锥体细胞明显水肿,核膜不完整,核染色加深,核内染色质凝聚成块,胞浆中内质网高度扩张,线粒体水肿;2%七氟醚组与对照组相似;4%七氟醚组细胞水肿不显,核膜完整,核内染色质轻度凝聚,内质网轻度扩张,线粒体无明显水肿。结论:4%七氟醚对大鼠海马脑片OGD损伤有保护作用,可能与减轻兴奋性Glu毒性有关。     

CNTF对NMDA引起大鼠海马神经元NOS活性改变的影响

为探讨CNTF对NMDA引起大鼠海马神经元一氧化氮合酶(nNOS)表达的作用,以不同浓度的NMDA处理海马神经元,倒置显微镜下观察其形态,并以nNOS免疫细胞化学结合图象分析方法测定nNOS神经元胞体的灰度,揭示NMDA对NOS活性的影响以及在此过程中CNTF发挥的作用。发现(1)NMDA可引起海马神经元的毒性反应,且呈剂量依赖性和时间依赖性;(2)100μmmol/L NMDA 10min组nNOS神经元胞体的灰度值大于对照组(P＜0．01);(3)在NMDA处理前给予CNTF,nNOS神经元的胞体及阳性突起的表现与对照组相似。提示CNTF可能通过抑制nNOS的活性及NO的渗出而减弱NMDA对神经元的毒性作用。     

心脏钙矛盾现象的研究

钙矛盾现象的形态学变化特点是细胞在闺盘处分离,细胞内肌节聚集为单一收缩带;心肌代谢的改变以高能磷酸键迅速减少、离子平衡失调为主。产生的机制是细胞膜钠泵、钙泵功能减弱,造成细胞排钙能力下降,细胞内 Na~+浓度升高,使恢复正常钙灌注时 Na~—Ca~(2+)迅速交换,造成 Ca~(2+)大量内流而导致一系列心肌细胞损伤。