采用GCaMP活体钙成像解析神经环路调控机制的研究策略及意义

大脑中的神经元通过集体行为建立相互连接,构成多种神经环路进而执行不同的功能。神经环路的研究方向即寻找构成各神经环路的神经元细胞,研究这些神经元是如何产生通讯互动以此构成特定的环路及环路本身在中枢神经系统行使的生命活动。众多研究已经证实,在解析生理或病理条件下神经环路调控机制过程中,通过实时监测神经元内重要生物传感器钙离子的变化可精确反映大脑组织内神经元活动。GCaMP活体钙成像方法有助于从单细胞水平揭示生理或病理状态下不同环路的调控机制。本文系统综述了GCaMP活体钙成像作为一种示踪技术在神经环路研究中的应用及进展,为神经环路和神经药理学的研究提供了参考依据。     

家兔脊神经节内肥大细胞与肽能神经关系的观察

探讨脊神经节内肥大细胞与肽能神经的关系,采用常规组织学染色和免疫组织化学方法对家兔脊神经节内肥大细胞和P物质免疫阳性反应进行观察。结果显示：在P物质免疫反应阳性的神经元和神经纤维周围散在着肥大细胞,表明,脊神经节内,肥大细胞与肽能神经存在着组织形态学上的构筑关系。     

心内神经元血管加压素的基因表达-原位杂交与免疫组织化学结合法研究

取中华蟾蜍心房后壁腔静脉窦部位组织作冰冻切片（30μm）,以原位杂交和免疫组织化学双标法进行心内神经节细胞的血管加压素mRNA(VPmRNA)及血管加压素免疫反应（VP-IR）染色观察,结果在心内神经节发现了3种标记细胞;（1）VP-IR阳性神经元;（2）VPmRNA阳性神经元;（2）VPmRNA和VP-IR双阳性神经元,VPmRNA和VP-IR双标记神经元证明部分心内神经节的细胞元内既有血管加压素（VP）的基因表达,又储存VP,从而说明VP系心内神经节的一种内源性神经递质,为心内神经节以VP为递质直接参与血液循环的调节提供了直接的分子生物学和化学神经解剖学证据。     

棕色田鼠小肠肌间神经丛NOS的组织化学观察

用NDP-黄递酶组织化学法研究了NOS在棕色田鼠（Microtus mandarinus)小肠肌间神经丛的分布,同样的方法对大白鼠进行了实验比较。结果发现,棕色田鼠小肠肌间祖辈 经丛NOS阳性神经元形态各异,大小悬殊数倍;在神经节和阳性神经纤维中可见阳性神经元呈“串珠”状和“U”型排列。10倍镜下记数100个视野,观察到阳性神经元平均密度为42.8个/mm^2,每个视野内平均有神经节12.4个,每个神经节内平均有NOS阳性神经元8.5个,占其神经节内神经元总数的27.2%,棕色田鼠为野生草食性动物,其NOS在小肠肌间神经丛的分布与其他杂食性啮齿类有相同之处,但也存在着种属差异。     

Semaphorin 3——下丘脑黑皮质素回路形成关键因子

下丘脑是机体代谢与能量平衡调控的重要神经中枢。下丘脑“黑皮质素”(melanocortin)神经环路参与能量稳态调节:该环路,由下丘脑弓状核POMC神经元、AgRP神经元、室旁核MC4R阳性神经元及三者间的神经投射共同构成。     

发现有四种肽类物质共存于豚鼠小肠粘膜下神经元

通常认为胃肠道粘膜下神经节可能是感受胃肠粘膜刺激的感觉神经元或支配胃肠粘膜的运动神经元或兼而有之。近年来应用免疫组织化学染色技术发现:豚鼠小肠粘膜下神经节的神经细胞中含有多种脑肠肽以及合成乙酰胆碱所必需的酶的免疫反应活性,例如胆囊收缩素(CCK)、神经肽Y(NPY)、生长抑素(SOM),P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)、胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的免疫活性。Furness等用相互间无交叉反应的高度特异性抗体同时标记豚鼠小肠粘膜下神经元中的不同抗原,再以荧光标记的高度特异性第二抗体标记第一抗体,研究了该神经胞体内各标记神经化学物质的共存情况。发现豚鼠小肠粘膜下神经节中神经元可分二大类:45%神经胞体中仅有VIP免疫反应性,主要集中在神经节中心,其神经末梢可能     

功能性ghrelin受体在内脏迷走和脊髓传入神经通路中的表达

本文在mRNA和蛋白水平观察了功能性ghrelin受体(growth hormone secretagogue receptor type la,GHS-Rla)在大鼠内脏迷走及脊髓传入神经通路中的表达.结果显示:(1)GHS-Rla免疫反应阳性神经元及GHS-Rla mRNA分布于背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)及结状神经节(nodose ganglion,NG).(2)应用免疫双标技术观察到DRG和NG中都有一些GHS-Rla免疫反应阳性神经元,同时降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)染色呈阳性,显示GHS-Rla和CGRP共存于同一神经元,表明内脏传入神经元存在许多亚核群.(3)应用荧光金(fluorogold)标记的神经逆行追踪技术对从胃投射到DRG和NG的神经元进行免疫组织化学染色,观察到一些表达CGRP的GHS-Rla免疫反应阳性神经元也被荧光金染色.上述实验结果证实了GHS-Rla在迷走神经和脊髓传入神经元中的表达,提示ghrelin参与了胃.脑轴的调节.     

编者按: 脑成像与脑网络

揭示脑的奥秘是人类面临的最大挑战之一。神经元是构成神经系统结构与功能的基本单位。神经元与神经元之间通过突触实现信息交互,并构成神经环路或神经网络。神经环路有局部的,也有跨脑区或长程的,甚至全脑尺度的。神经环路则是脑实现神经信息处理的基本单元。若干神经环路构成脑网络。脑网络研究已经成为脑功能与脑疾病研究领域的热点。 在国家自然科学基金委员会和科技部“973计划”等项目的支持下,我国科学家在这一领域已经开展了卓有成效的工作。2011年第393次香山科学会议“脑网络组及其临床应用的前沿科学问题”曾对此进行过比较深入的研讨。为促进对该领域现状及发展的了解,本期汇集了2篇述评和2篇研究论文,作为脑成像与脑网络专题发表,以飨读者。 利用9.4T功能磁共振成像(fMRI)获得轻度麻醉状态下大鼠静息状态及刺激激活的数据,通过互相关分析构建节点之间的相关系数矩阵并计算相应的网络参数,赖永秀等人报道了大鼠感觉运动系统静息态脑网络的研究成果,发现感觉运动系统在静息态时的脑网络具有小世界属性。 扩散磁共振成像(dMRI)的出现为大脑结构与功能研究提供了全新的检测手段,雷皓等报道了小动物高分辨扩散磁共振成像数据分析方法,为小动物脑dMRI研究提供了统一图像模板与完善的计算方法,对于检测神经纤维微观结构的变化,以及临床诊断,将具有极其重要的意义。 神经环路功能变化的实时在体监测是研究脑网络不可或缺的手段,曾绍群等评述了基于声光偏转器的快速无惯性随机扫描双光子显微成像技术的研究进展及发展趋势,指出该技术的进一步发展将为神经活动观测提供一种全新的方法,从而极大地推动脑科学研究的发展。 针对哺乳动物全脑的神经元网络成像,龚辉等从空间分辨率、探测范围、数据配准和成像速度等方面评述了光学显微水平全脑成像方法的研究进展,并讨论所面临的挑战。他们指出,要在全脑尺度获取突起水平分辨率的结构与功能数据,光学成像方法最为成熟。华中科技大学研制的MOST系统,率先获得了一系列高分辨率的完整大脑解剖数据集,该成果将在神经元网络的构建和脑功能与疾病研究中发挥重要作用。 我们期待更多、更好的有关脑成像与脑网络的论文发表,以更广泛和深入地促进我国脑科学研究领域的学术交流。     

甘肃鼢鼠胃肠道肌间神经丛一氧化氮合酶阳性神经元的分布

用NADPH-黄递酶组织化学法及整装铺片技术,对甘肃鼢鼠(Myospalax cansus)胃肠道肌间神经丛NOS阳性神经元的分布进行研究.结果显示,甘肃鼢鼠胃肠道肌间神经丛NOS阳性神经元分布广泛,形态多样,神经元大小不同,阳性神经节与阳性神经纤维束形成网络;胃肠道不同部位NOS阳性神经元密度有差异,结肠最高,直肠次之.从十二指肠至回肠段,NOS阳性神经元密度整体呈上升趋势;胃与空肠、十二指肠与盲肠间NOS阳性神经元密度无显著差异,其他各段之间差异显著.甘肃鼢鼠胃肠道肌间神经丛NOS阳性神经元分布与其他已研究动物的分布模式基本一致.     

肝细胞生长因子在正常大鼠腰段脊髓和背根神经节的表达

目的:观察肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在大鼠脊髓和背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)的表达。方法:取健康成年6只SD大鼠运用免疫组织化学染色技术检测HGF在腰段脊髓、背根神经节内的表达和分布。结果:在L4-6段脊髓,HGF免疫阳性产物可见于各板层神经元,尤以脊髓前角运动神经元明显;在DRG中,HGF免疫阳性物质可见于以大、中型为主的神经元的胞浆及突起中。结论:脊髓和背根神经节内的HGF通过与受体c-Met结合可能在神经再生及突触可塑性方面起一定作用。     

大鼠背根神经节细胞—氧化氮合酶与乙酰胆碱酯酶共存的组织化学研究

用还原型尼克项胺腺嘌呤二核苷磷酸黄递酶反应,结合乙酸胆碱酯酶组织化学技术,观察了SD大鼠背根神经节,发现背根神经节内存在有四种不同显色的神经元。（1）AChE阳性神经元（8％）。（2）NADPH－d阳性神经元（2％）。（3）NADPH－d与AChE双显色神经元（90％）。（4）少数两种酶反应均为阴性神经元。其中双显色神经元胞质内含有蓝色和棕色两种颗粒。这证明背根节内存在许多NADPH－d与AChE共存的神经元。提示了背根节内NADPH－d与AChE双染神经元可能与痛感知的传递有关。     

幼年斑马鱼的视觉系统与捕食行为

神经环路的研究是揭示动物行为神经机制的关键。斑马鱼作为一种低等脊椎动物, 在神经环路的研究中有着独特优势。文章描述了斑马鱼视觉系统及其下游的神经环路, 重点讨论了它们在捕食行为中的可能作用。斑马鱼捕食行为主要依赖于视觉功能, 该过程涉及到视觉-运动通路各个层次的神经环路, 包括下游的网状脊髓命令神经元、脊髓内部的运动控制环路以及一些亟待研究的功能单元。随着在体记录和操纵神经元活动技术的成熟, 以及行为学范式的完善, 对斑马鱼捕食行为相关神经环路的研究将在未来数年内迅速发展, 同时也将推动神经科学相关研究的进步。     

大鼠胃肌间神经丛中NOS阳性神经元的组织化学研究

采用ＮＡＤＰＨ┐黄递酶（ＮＤＰ）组织化学技术在整装铺片上对大鼠胃肌间神经丛中一氧化氮合酶（ＮＯＳ）阳性神经元进行定量和定位研究。结果显示：大鼠胃肌间神经丛中ＮＯＳ阳性神经元密度（个／ｍｍ２）分别为：６２．１±３７．７（幽门部）、４３．４±３１．７（胃体）、３１．６±２７．８（胃底）。胃底部神经节内神经元数量较少,神经元胞体较大,染色较深;幽门部神经节内神经元数量较多,胞体大小不等,染色深浅不一;胃体部的则介于两者之间,呈过渡态。结果表明：胃各部肌间神经丛中ＮＯＳ阳性神经元的差异可能与胃的生理功能密切相关     

大脑神经联接图谱的研究进展

脑科学旨在阐明神经系统结构和功能,揭示大脑工作的神经机制.由于大脑中神经元数量庞大,神经元形态和功能种类多样,神经元之间的结构与功能联接错综复杂,使得研究脑工作原理尤具挑战.因而,在全脑尺度上绘制神经元之间的联接,即神经联接图谱,揭示大脑各脑区、核团、神经元之间的功能和结构联系,是全面理解脑工作原理的基础.近几年,多维度多模态成像、神经环路示踪与功能调控、图像处理等技术的进步,推动了神经联接图谱研究的迅速发展,使人们得以在局部脑区乃至全脑尺度上观察神经元的形态、联接与活动.本文总结近年来宏观、介观、微观脑神经联接图谱相关技术的进步和神经环路结构与功能研究的进展,对脑联接图谱研究领域面临的挑战与发展趋势加以探讨,并提出斑马鱼(Danio rerio)是目前在全脑尺度上阐释脑结构和功能神经联接图谱的理想动物模型.     

双顺反子表达技术在线虫神经元钙成像中的应用

在线虫中,钙成像技术已被广泛用于检测不同神经元的活性.然而,对于准确记录爬行中的活体线虫神经元钙信号仍然存在许多挑战,其中一个困难即来自于标记目标神经元。在同一个目标神经元中共同表达基因编码的钙指示蛋白和常量参考值荧光蛋白常常具有无法共表达的不确定性.另外,光谱的串扰影响存在于目前最常用的绿色钙指示蛋白系列G-CaMP与其参考值荧光蛋白DsRed系列之间,光谱的串扰有时会给信号记录带来假阳性结果.综上所述,本文首次提出应用双顺反子表达技术用于同一神经元的双蛋白标记,这不仅提高了共表达效率,更简化了线虫神经元标记的工作量.同时,本文还首次采用mKate2,一种与G-CaMP没有串扰的红色荧光蛋白作为参考量.以上改进已在感觉神经元ASH中得到验证.希望本文提出的方法能给线虫神经回路的研究提供一个更为方便、有效的途径.     

神经节苷脂GM1对帕金森模型小鼠黑质细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响

目的观察神经节苷脂GM1对帕金森模型小鼠黑质细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响,探讨其预防帕金森病的机制。方法成年C57-BL雄性小鼠分为正常对照组、模型组和神经节苷脂GMI治疗组。应用TUNEL法和免疫荧光组织化学染色技术观察各组小鼠黑质神经元凋亡及Bcl-2和Bax表达情况。结果TUNEL、Bcl-2和Bax阳性神经元主要位于黑质致密部。模型组黑质神经元凋亡数明显多于正常对照组,神经节苷脂GM1组黑质神经元凋亡数明显少于模型组。在模型组Bcl-2阳性神经元和Bax阳性神经元的数量均较正常对照组明显增多;在神经节苷脂GM1组Bcl-2阳性神经元的数量较模型组明显增多,但Bax阳性神经元的数量较模型组明显减少。结论神经节苷脂GM1可能通过增强黑质神经元内Bcl-2基因表达及抑制Bax基因表达的途径抑制黑质神经元的凋亡。     

5-羟色胺和一氧化氮合酶在大鼠中脑导水管周围灰质 和中缝核簇神经元内的共存

实验采用 NADPH组织化学和 5 - HT免疫组织化学双重显色方法研究了 5 - HT和一氧化氮合酶在大鼠中脑导水管周围灰质 (PAG)和中缝核簇神经元的分布特征及共存情况。结果表明 ;(1 )在 PAG腹外侧区中观察到大量的 NOS阳性神经元和 5 - HT样免疫阳性神经元 ,但是 NOS/ 5 - HT双标神经元较少 ,仅占该区 5 - HT样免疫阳性神经元 2 0 .1 % ,并且主要分布在该区的内侧部 ;在 PAG的背外侧区中观察到密集的 NOS阳性神经元 ,但是几乎未见 5 - HT免疫阳性神经元分布。(2 )在中缝核簇的大多数亚核内均可观察到大量的 NOS神经元和 5 - HT免疫阳性神经元。在中缝背核的内侧部、中缝背核的尾侧部、中缝正中核、尾侧线形核、中缝大核和中缝隐核内双标神经元分别占所在部位中 5 - HT免疫阳性神经元的 44 .6 %、5 3.4%、 44 .4%、 2 6 .2 %、 2 6 .7%和 2 1 .8%。然而在中缝苍白核内仅偶见少数双标神经元。研究结果表明 ,在 PAG和中缝核簇的一些神经元内 5 - HT可以与 NOS共存 ,提示这两种神经活性物质在功能上可能存在着某种相关性 ,有关这些双标神经元的功能意义尚需进一步研究。     

P2X3受体在感觉神经节的表达

用免疫组织化学与原位杂交研究P2X3受体在背根神经节,三叉神经节和结状神经节的分布。结果显示：1、原位杂交;在三种感觉神经节中,95%左右的神经节细胞为P2X3mRNA阳性,中、小型神经节细胞的杂交信号一般要比大型的神经节细胞强一些,2、免疫组织化学;免疫组织化学结果与原位杂交结果基本一致。此外,在各神经节内,均显示出许多P2X3免疫阳性神经纤维,在足掌表皮也显示许多P2X3免疫反应阳性纤维,结果提示：P2X3不仅参与机体的痛觉的形成,还可能参与其它感觉,如本体感觉等的形成。     

P2X_3受体在感觉神经节的表达

用免疫组织化学与原位杂交研究 P2 X3受体在背根神经节、三叉神经节和结状神经节的分布。结果显示 :1.原位杂交 :在三种感觉神经节中 ,95 %左右的神经节细胞为 P2 X3m RNA阳性 ,中、小型神经节细胞的杂交信号一般要比大型的神经节细胞强一些。 2 .免疫组织化学 :免疫组织化学结果与原位杂交结果基本一致。此外 ,在各神经节内 ,均显示出许多P2 X3免疫阳性神经纤维 ,在足掌表皮也显示许多 P2 X3免疫反应阳性纤维。结果提示 :P2 X3不仅参与机体的痛觉的形成 ,还可能参与其它感觉 ,如本体感觉等的形成     

5—羟色胺和一氧化氮合酶在大鼠中脑导水和周围灰质和中缝核簇神经元内的共存

实验采用NADPH组织化学和5－HT免疫组织化学双重显色方法研究了5－HT和一氧化氮合酶在大鼠中脑导水管周围灰质（PAG）和中缝核簇神经元的分布特征及共存情况。结果表明：（1）在PAG腹外侧区中观察到大量的NOS阳性神经元和5－HT样免疫阳性神经元,但是NOS／5－HT双标神经元较少,仅占该区5－HT样免疫阳性神经元20.1%,并且主要分布在该区的内侧部;在PAG的背外侧区中观察到密集的NOS阳性神经元,但是几科未见5－HT免疫阳性神经元分布。（2）在中缝核簇的大多数亚核内均可观察到大量的NOS神经元和5－HT免疫阳性神经元。在中缝背核的内侧部、中缝背核的尾侧部、中缝正中核、尾侧线形核、中缝大核和中缝隐核内双标神经元分别占所在部位中5－HT免疫阳性神经元的44.6%、53.4%、44.4%、26.2%、26.7%和21.8%。然而在中缝苍白核内仅偶见少数双标神经元,研究结果表明,在PAG和中缝核簇的一些神经元内5－HT可以与NOS共存,提示这两种神经活性物质在功能上可能存在着某种相关性,有关这些双标神经元的功能意义尚需进一步研究。