牦牛AQP4基因CDS序列的克隆及其生物信息学特征分析

为了研究高原动物对青藏高原高寒、低氧等极端生境的适应机理,进一步探讨高原动物对高原反应——高原脑水肿抗性的分子机理,运用基因克隆与生物信息学相关技术和方法,对牦牛脑AQP4(水通道蛋白4,AQP4)基因CDS全长序列进行克隆、基因序列比对及其生物信息学特征分析。结果表明,牦牛AQP4的CDS含有一个966 bp的开放阅读框,编码322个氨基酸;牦牛AQP4基因编码蛋白分子量34.69 k D,理论等电点(p I)7.59,其编码蛋白含有6次跨膜结构,属于疏水性蛋白;二级结构主要由α-螺旋、延伸及无规则卷曲构成;AQP4基因编码产物氨基酸同源性及系统进化分析发现,牦牛AQP4基因编码氨基酸序列与黄牛、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。     

牦牛Eppin基因CDS的克隆及其在附睾不同区段中的表达研究

为了研究牦牛附睾组织中精子成熟的相关机理,并为探讨高原动物的生殖机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛附睾Eppin基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,Eppin基因和编码序列特征进行了预测和分析。结果表明,牦牛Eppin基因的CDS含有一个405 bp长度的片段,由134个氨基酸编码;牦牛Eppin基因对应的蛋白分子量和理论等电点分别为15.09 ku和8.67 ku,其对应的氨基酸没有跨膜结构,归于近水性蛋白;25个α-螺旋、27个延伸链、2个β-折叠及80个无规则卷曲构成其蛋白质二级结构;牦牛Eppin基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究应用实时荧光定量PCR技术分析Eppin基因在附睾组织3个不同区段(头部,颈部和尾部)中的表达情况,荧光定量PCR结果显示,Eppin基因在牦牛附睾组织3个不同区段中均有不同程度的表达,在附睾头部中表达最高,颈部和尾部表达较低。本研究将为牦牛附睾精子成熟的机制和Eppin基因在牦牛附睾上皮细胞中的功能提供一定的基础数据。     

不同海拔饲育的麦洼牦牛肺脏组织转录组学分析

为了探讨牦牛适应高海拔低氧环境的基因表达特征与规律,对在高海拔（3 560 m）和低海拔地区（478 m）饲育4个月的2.5~3岁健康雄性麦洼牦牛肺组织进行转录组测序。转录组测序采用Illumina高通量测序平台(HiSeqTM2500/4000)进行,并以qRT-PCR验证差异表达基因的表达量。结果显示,高海拔组牦牛肺脏转录组平均每个测序样本得到约5.76亿条Clean Reads,低海拔组牦牛中得到约6.10亿条Clean Reads,比对到参考基因组上的Reads数分别占91.74%和91.28%以上,共发现了2 047个新转录本。低海拔组与高海拔组牦牛肺脏组织之间共有199个差异表达基因,其中含89个差异上调表达基因和110个差异下调表达基因。所得差异表达基因富集在297个GO条目和146个KEGG通路中,包含62个低氧适应相关的GO条目和35个低氧适应相关代谢通路。其中低氧适应相关GO条目在生物过程、细胞组成和分子功能三种类别中占比最多的分别为细胞粘附、蛋白复合物和钙离子结合。低氧适应相关KEGG通路中占比最多的为肿瘤坏死因子(TNF)信号通路,其次为低氧诱导因子1(HIF-1)信号通路。qRT-PCR验证结果显示,Ⅱ类人类白细胞抗原α链(HLA-DOA、HLA-DRA)、补体因子 (C2)和甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1（MASP1）基因的表达量变化与转录组测序结果相符。本研究为全局和深入理解牦牛肺组织转录本表达对高海拔低氧的响应提供了有价值的切入点。     

大通牦牛ApoA1基因克隆及生物信息学分析与组织表达谱分析

本试验旨在分析大通牦牛(Bos grunniens)ApoA1基因的分子特征,并检测其在不同组织的表达规律,为进一步研究ApoA1基因的功能提供理论依据。试验以牦牛肝脏cDNA为模板,通过PCR扩增和基因克隆获得牦牛ApoA1基因编码区序列(coding region sequence, CDS),并进行生物信息学分析;利用RT-qPCR技术检测ApoA1基因mRNA在心脏、肌肉、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、子宫角、脂肪和输卵管等组织中的mRNA表达水平。结果表明,大通牦牛ApoA1基因编码区序列长798 bp,编码265个氨基酸;ApoA1蛋白质的分子质量为30 324.414 Da,理论等电点为5.71;蛋白质二级结构以α-螺旋(93.58%)为主;牦牛ApoA1蛋白为不稳定亲水蛋白,存在信号肽,为分泌蛋白,不存在跨膜结构域;牦牛ApoA1基因的核苷酸序列与黄牛相应序列相似度最高,同源性为99.64%;组织表达谱分析表明,ApoA1基因在大通牦牛不同组织中都表达,但在肝脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05)。这些结果为进一步研究大通牦牛ApoA1基因在大通牦牛结构和功能...     

牦牛KLF3基因克隆及组织表达分析

旨在克隆牦牛KLF3基因序列,并获得其生物学特征,同时阐明其组织表达规律。选取4-6周岁的健康麦洼牦牛6头,采集脾、肺、肾、皮下脂肪和背最长肌组织样品,提取组织总RNA,利用RT-PCR方法克隆KLF3基因序列,同时利用荧光定量PCR(q PCR)技术检测该基因在不同组织中的表达情况。结果表明,获得牦牛KLF3基因序列1 137 bp(Gen Bank登录号:KX964630),其中CDS为1 041 bp,5'UTR 32 bp和3'UTR 64 bp,编码346个氨基酸,牦牛KLF3氨基酸序列与普通牛(XP_010820342.1)的氨基酸序列同源性达100%。KLF3 m RNA在牦牛肺脏和肝脏的表达水平较高,极显著高于其他组织(P0.01)。     

低氧环境对高原鼢鼠不同组织VEGF165b基因表达量及微血管密度的影响

目的：探讨高原低氧环境下高原鼢鼠不同组织血管内皮生长因子165b （VEGF_165b）表达量及微血管密度（MVD）的变化。方法：克隆高原鼢鼠VEGF_165b基因并测定其在不同海拔脑、肺和骨骼肌组织内的表达量;免疫组化法观察脑、肺和骨骼肌组织内微血管并测定其在不同海拔组织内的密度。结果：高海拔VEGF_165b表达量显著低于低海拔表达量（P<0.05）;微血管密度随海拔高度升高而增加（P<0.05）。结论：VEGF_165b基因调节动物组织微血管密度是高原动物适应低氧环境的重要机制之一。     

高原鼢鼠神经型一氧化氮合酶基因编码区序列克隆与分析

高原鼢鼠是青藏高原特有的地下鼠,受到高原低氧以及洞穴低氧的双重低氧环境压力。经RNA 提取、RT-PCR、亚克隆与测序,本研究获得高原鼢鼠神经型一氧化氮合酶(nNOS)的编码区序列,并对其分子特征进行了分析。结果显示:高原鼢鼠nNOS 基因编码区(CDS)全长4 290 bp,编码1 429 个氨基酸残基;CDS 与大鼠、小鼠、兔、狗、人的同源性分别为90% 、89% 、87% 、87% 、89% ;结构域上,高原鼢鼠nNOS 具有PDZ蛋白结构域、氧化域、还原域及钙调素结合位点等nNOSs 所具有的典型结构域;基于nNOS 的最大似然树和贝叶斯树均支持高原鼢鼠与大鼠、小鼠具有最近的亲缘关系,与形态或其它分子标记构建的进化关系相符;分子进化分析检测到高原鼢鼠nNOS 中存在3 个正选择位点---332 T、1200 G 和1334 P,但均未达到统计显著水平。本研究为揭示高原鼢鼠nNOS 的表达特征及其在低氧适应中的作用与调控机制研究奠定了初步基础。     

牦牛KISS-1基因的克隆及其在生殖轴的表达

KISS-1在动物繁殖调控中具有重要作用,旨为探讨KISS-1基因在牦牛季节性繁殖中的调控作用。实验采集5头成年母牦牛和5头黄牛的下丘脑、垂体等组织,利用RT-PCR和q PCR技术研究其KISS-1基因序列及组织表达特性。结果表明,牦牛和黄牛KISS-1基因编码区长度为408 bp,编码135个氨基酸,比对分析发现牦牛和黄牛基因编码区存在7处碱基突变。牦牛KISS-1基因氨基酸序列与黄牛、藏山羊、绵羊、野猪、人和褐家鼠的同源性分别为97%、85%、65%、55%和51.5%。KISS-1基因m RNA在牦牛和黄牛的下丘脑、垂体、卵巢、输卵管及子宫中均有表达。在下丘脑和脑垂体的表达丰度高,但两物种间无显著性差异(P0.05)。说明KISS-1基因在动物进化中比较保守,对牦牛季节性繁殖的调控作用有待进一步研究。     

青藏高原高原鼠兔Na+,K+-ATP酶β2亚基基因编码区的克隆与分析

目的:克隆青藏高原高原鼠兔Na ,K -ATP酶β2亚基(ATP1B2)的基因编码区,并分析其序列特征,以揭示高原鼠兔低氧适应的分子基础。方法:采用RT-PCR技术从高原鼠兔脑组织中扩增出ATP1B2基因编码区cDNA序列并进行序列测定,采用生物信息学技术对其进行分析。结果:ATP1B2基因编码区由873bp组成,编码290个氨基酸残基。序列分析结果显示,高原鼠兔ATP1B2编码区的核酸序列与兔、人、牛、大鼠、小鼠及狗分别有99%、93%、91%、91%、90%和90%的同源性。结论:克隆出青藏高原高原鼠兔ATP1B2基因编码区,为进一步了解高原鼠兔低氧适应的分子机制提供了基础。     

藏羚羊组蛋白去乙酰化酶1 基因编码区的克隆与序列分析

为探讨藏羚羊的低氧适应机制与高原低氧环境的相关性,采用RT-PCR 技术,首次从藏羚羊心肌组织总DNA 中克隆出组蛋白去乙酰化酶1 (Histone deacetylase1,HDAC1)基因的编码区序列。该序列全长为1 449 bp,
编码482 个氨基酸,预测其蛋白质分子量约为55 kDa。序列分析表明,藏羚羊HDAC1 基因的编码区序列与其它哺乳动物相似性超过90% ,其中与牛的相似性最高为98.27% ;它的氨基酸序列与其它哺乳动物的相似性达到
98.76% ～ 99.59%,显示出极高的保守性。利用邻接法(Neighbor-Joining,NJ 法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,藏羚羊与牛先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。藏羚羊HDAC1 基因编码区的成
功获得,为进一步揭示藏羚羊低氧适应的表观遗传机制奠定基础。     

牦牛SND1基因特征序列分析及其蛋白在乳腺的表达

Staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1（ SND1,Tudor-SN）是一种参与基因调控的转录共激活因子蛋白,本研究意在克隆牦牛泌乳相关基因SND1,分析其生物特性,研究其蛋白在乳腺的表达。采集牦牛泌乳期乳腺组织,胰蛋白酶消化法得到原代乳腺上皮细胞,纯化到3代, 采用RT-PCR扩增克隆SND1基因,测序并拼接,并用相关生物信息软件分析牦牛SND1基因特性;用免疫组织化学和免疫荧光技术对牦牛SND1基因编码蛋白进行定位分析。获得如下结果：牦牛SND1基因全序列为3294 bp,含有2733 bp的ORF,共包含20种氨基酸。SND1基因编码蛋白为非分泌蛋白,非跨膜蛋白;同源性分析显示,牦牛SND1基因与野牛、家牛、藏羚羊、山羊、猪、野骆驼、马、黑猩猩、人、褐家鼠的同源性分别为99%、98%、96%、94%、91%、90%、90%、89%、89%、85%;系统进化树表明与野牛和家牛的进化水平较近,与人和鼠的进化水平较远。免疫组织化学染色结果显示,SND1蛋白在分泌上皮细胞（乳腺上皮细胞）和导管上皮细胞呈阳性高表达,在肌上皮细胞呈弱表达。免疫荧光显示,SND1蛋白在乳腺上皮细胞胞核高表达,胞质弱表达。上述研究结果为进一步探究SND1对牦牛泌乳机能的调节提供了相关依据,也为高寒哺乳动物的研究提供了参考资料。     

野牦牛和家牦牛粪便菌群与短链脂肪酸关系的研究

短链脂肪酸(SCFA)是反刍动物吸收饲草、饲料中营养物质的重要形式。肠道菌群能够降解食物生成SCFA并影响其比例。本文通过16S r DNA测序和气相色谱质谱联用仪,分别测定了野牦牛(Bos mutus)和家牦牛(Bos grunniens)粪便菌群组成及SCFA含量,通过比较分析两种牦牛肠道菌群与SCFA的关系,筛选出野牦牛肠道中与SCFA高浓度有正相关关系的菌群。结果显示,野牦牛粪便菌群主要有厚壁菌门(Firmicutes)(66. 47%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(26. 00%)和变形菌门(Proteobacteria)(3. 48%),主要的科有瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)(55. 18%)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)(8. 75%)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)(7. 57%),家牦牛的菌群结构和组成与野牦牛相似。野牦牛粪便中SCFA以乙酸和丙酸为主,乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸和正戊酸的含量均显著高于家牦牛(P <0. 01)。Spearman相关分析显示,野牦牛粪便菌群中紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、普雷沃氏菌科(Paraprevotellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)与SCFA具有较强相关性(r> 0. 4),而家牦牛仅有弱相关性(r <0. 3)。说明牦牛后肠道具有丰富的能够促进SCFA生成的益生菌群,进而提高食物的转化效率。     

MTNR1a和MTNR1b在牦牛不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

褪黑素对调节季节性繁殖哺乳动物的生殖具有重要调节作用。其受体MTNR1a（Melatonin receptor 1a,褪黑素受体1a）主要参与昼夜节律和生殖调控,MTNR1b（Melatonin receptor 1b,褪黑素受体1b）与多种疾病发生密切相关。为了探讨褪黑素受体基因的生物学功能,本实验对牦牛不同组织中MTNR1a、MTNR1b基因的表达与定位情况进行了研究。采用qRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR) 检测成年雄性牦牛各组织及不同发育阶段（30日龄,2岁、4岁、6岁和8岁龄）牦牛睾丸组织中MTNR1a、MTNR1b mRNA的表达规律,并运用免疫组化技术对不同年龄牦牛睾丸中MTNR1a、MTNR1b蛋白进行了定位研究。结果发现,MTNR1a mRNA在松果体组织中表达量最高,肺脏、肌肉和睾丸次之;随着年龄增加,MTNR1a mRNA在睾丸中的表达量逐渐升高,到4岁后表达量趋于平稳;MTNR1a蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸组织中均有表达,圆形精子呈现较强的免疫阳性,其次为初级精母细胞;MTNR1b mRNA在松果体表达量最高（P<0.05）,肾脏、肝脏和下丘脑次之;在不同年龄牦牛睾丸中MTNR1b mRNA均有表达,且随着年龄的增加表达量逐渐增加,在8岁时表达量最高;MTNR1b蛋白主要定位在圆形精子细胞中。MTNR1a、MTNR1b基因在牦牛不同组织及不同发育阶段睾丸中的广泛表达,揭示了其在雄性牦牛生殖等生理过程中的重要作用。     

牛c-myc基因的克隆及其在皮肤成纤维细胞中的表达

为了构建包含牛c-myc基因编码序列的重组载体,以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛c-myc 基因的编码序列,将其亚克隆至pMD19-T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体上,挑选序列正确的重组真核表达质粒转染牛皮肤成纤维细胞,用RT-PCR和Western blotting分别检测c-myc mRNA和蛋白的表达。结果表明,从胎牛原始生殖嵴中正确克隆了c-myc基因的全长编码序列,所构建的重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中有效     

牦牛水通道蛋白AQP1和AQP3基因克隆及在不同组织中表达和定位

水通道蛋白(Aquaporin,AQP)广泛存在于生物体的各组织部位,影响着生物体水代谢的过程.为进一步研究水通道蛋白1(AQP1)和水通道蛋白3(AQP3)生物学功能,本文对牦牛(Bos grunniens)不同组织中 AQP1和AQP3基因的表达与定位进行了研究.采用PCR方法扩增牦牛AQP1和AQP3基因,对其序...     

鼹科长吻鼩鼹和库氏长吻鼹的首次转录组分析

现生的鼹科动物分布于欧亚大陆和北美大陆,包括54种已知物种。鼹科动物有丰富的生态类型,是研究适应性进化的较好模型。本研究通过二代测序的方法分别获得了长吻鼩鼹和库氏长吻鼹两个物种心脏和肺脏以及脾脏和肺脏的转录组数据。这两个物种分别代表了分布于中国西南部、缅甸北部的没有特化的原始类群鼩鼹亚科以及高度适应地下生活的鼹亚科鼹族。我们首次报道了库氏长吻鼹在中国的分布。通过从头拼接,分别获得长吻鼩鼹和库氏长吻鼹197 092个和225 956个转录本,以及125 427个和94 023个unigene。通过与GenBank中的基因组注释文件比对,得到鼹科物种同源基因家族8 376个,及鼹科鼩鼱科同源基因家族8 114个。差异表达基因中各组织的高表达基因中均找到10个以上组织特异性基因。然而BUSCO分析确定完整单拷贝基因在两个物种中分别为43.0%和56.6%,提示死后mRNA迅速降解并影响转录组拼接。比较两个物种肺部基因的表达差异发现库氏长吻鼹335个相对高表达的基因,其中包括HMGB1、HSPD1、SF3B1、COL3A1、SUMO1和JUNB等,有报道上述基因可能与低氧或高海拔适应有关。     

Construction, characterization and expression of full length cDNA clone of sheep YAP1 gene

RT-PCR, 5′RACE, 3′RACE were used to clone sheep full length cDNA sequence of YAP1 (Yes-associated protein 1), eukaryotic expression plasmid and a mutant that cannot be phosphorylated at Ser42 was successfully constructed. The amino acid sequence analysis revealed that sheep YAP1 gene encoded water-soluble protein and its relative molecular weight and isoelectric point was 44,079.0 Da and 4.91, respectively. Sub-cellular localization of YAP1 was in the nucleus, it is hydrophilic non-transmembrane and non-secreted protein. YAP1 protein contained 33 phosphorylation sites, seven glycosylation sites and two WW domains. The secondary structure of YAP1 was mainly composed of random coil, while the tertiary structure of domain area showed a forniciform helix structure. YAP1 gene was expressed in different tissues, the highest expression was in kidney and the lowest was in hypothalamus. The CDS of sheep YAP1was amplified by RT-PCR from healthy sheep longissimus dorsi muscle, cloned into pMD19-T simple vector by T/A ligation. YAP1 coding region was further sub-cloned into pEGFP-C1 vector by T4 Ligase to construct a eukaryotic expression plasmid and then make the eukaryotic expression vector as the template to construct the phosphorylation site mutant. PCR, restriction enzyme and sequencing were used to confirm the recombinant plasmid. The sheep full-length YAP1 cDNA sequence is 1712 in length encoding 403 amino acids. It was confirmed that the sheep YAP1 CDS was correctly inserted into eukaryotic expression vector and serine had been mutated to alanine by PCR, restriction digestion and sequencing. The result showed that the recombinant plasmid pEGFP-C1-YAP1 and pEGFP-C1-YAP1 S42A was constructed correctly, this will help for further studies on the YAP1 protein expression and its biological activities.     

Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in the genome of Yak (Bos grunniens)

The researches on yak genetics and breeding were extremely restricted due to lacking of reliable DNA molecular markers. The microsatellites with repeat motif (AC)_n/(GT)_n in yak genome were enriched by Dynal magnetic beads and the gene libraries containing (AC)_n/(GT)_n were constructed. Among the 92 identified and sequenced positive clones, 40 contained perfect repeats (43.48 %), 41 contained imperfect repeats (44.57 %) and 11 contained compound repeats (11.96 %). As compared with the percentage of perfect repeats, no significant increases of imperfect repeats were observed in yak genome, which indicated that the level of adaptive evolution of the ability to repair damaged genomic DNA for yaks were high enough to endure the natural pressure of nucleotide substitution resulted from ultraviolet irradiation in high-altitude areas. Totally 19 polymorphic microsatellite loci were screened and genotyped on the basis of electropherograms on an ABI 310 Genetic Analyzer. All the loci exhibited moderate to high-level polymorphisms in a test population of Bos grunniens and the polymorphic information content ranged from 0.299 to 0.861 (mean 0.678). The newly isolated (AC)_n/(GT)_n repeats from yak genome will display their potential values in examining intra-population genetic structure and inter-population relationships, and also in investigating molecular markers for production and adaptive traits of individual/population.     

Construction of a recombinant eukaryotic expression plasmid containing human PDLIM2 gene and its biological activity

In order to obtain a full-length expression plasmid for human PDLIM2 gene, fragment amplification was used to clone its full-length coding sequence (CDS) region. The amplified PCR product was then digested and inserted into the pMD 18-T vector and subcloned into the pIRES2-EGFP plasmid to form the pIRES2-EGFP-PDLIM2 eukaryotic expression vector. After it was transfected to the bladder cancer cell line, BIU-87, the biological activities of high expression were verified by RT-PCR and Western blotting. Meanwhile the mRNA and protein expressions of p65 were detected. Finally we analyzed the effect of overexpressed PDLIM2 on BIU-87 cell proliferation. In conclusion, a recombinant eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-PDLIM2 containing the complete CDS region of PDLIM2 was successfully constructed. PDLIM2 negatively regulated p65 expression and inhibited BIU-87 cell proliferation. We laid the foundations for further research into the function of the PDLIM2 gene in bladder cancer.