一种简便快速的单引物PCR定点突变方法

为了解决在一些特殊位点上利用Quick Change方法进行定点突变时会在突变位点处额外插入引物序列导致突变失败的问题,对Quick Change法进行了改良。改良方法为:合成在突变位点处点突变的一对反向互补引物,分别进行单引物PCR扩增,将两种扩增产物混合,变性复性后加入Dpn I进行酶切,酶切产物转化大肠杆菌DH5α,抗性筛选阳性克隆进行测序验证。利用此法成功突变紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase,ADS)基因中多个利用常规方法突变均因引入额外引物而无法成功的特殊位点,证明此方法实践上可行,而且也可以避免插入额外引物序列,这也从侧面证明额外引物插入的原因是双引物同时反应。     

改进的多片段重叠延伸PCR制作基因多位点突变

为在研究工作中提高制作目标基因多位点突变体的效率,对常规重叠延伸PCR进行适当改进:对于相距较近的两个突变位点,只需设计一对突变引物各自涵盖其中一个位点即可一次突变;对于相距较远的两个位点,可以采用三片段重叠延伸PCR的办法解决;两者结合则可一次性突变多个位点。以制作RBCT的6位点突变体PSM6为例,利用上述策略,设计两对突变引物;采用OE-PCR法,第一轮PCR扩增出三个片段,第二轮PCR同时利用三片段重叠延伸产物作为模板扩增出目标基因突变体,再按常规分子克隆方法将其连入质粒载体。经测序检测,发现得到了预期的目标基因多位点突变体。因此,采用灵活的引物设计策略,结合多片段重叠延伸PCR即可一次性制作基因的多位点突变体,此方案可解决研究工作中大多数多位点突变问题。     

用DREAM技术纠正人工合成基因中的突变

目的：介绍一种简便、有效的定点突变技术。方法：根据突变位点附近的DNA序列推导出氨基酸序列,再以此氨基酸序列进行逆翻译,这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变体（silent mutants）,这些突变体中包含大量的限制性内切酶位点,选择合适的酶切位点设计引物用PCR技术扩增两侧DNA片段,然后以相应酶切融合这两个片段即可完成定点突变。结果：用该方法成功地在人工合成的含有缺失的可溶性组织因子基因的472位插入C,T两个碱基,校正了阅读框架,获得了预期的目的基因。结论：该方法简便、有效, 避免了多轮PCR和合成长引物导致突变的可能性,这种改进的PCR 定点诱变技术我们称之为“设计限制酶辅助突变”（Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis, DREAM）。此技术简单方便, 诱变的成功率高, 适于实验室常规应用。     

以P型职PRSV-VPg为模板多位点突变获得W型PRSV-VPg的研究

以P型PRSV-VPg(Papaya Ringspot Virus,VPg gene)基因为模板利用高保真酶通过两对引物(突变4个位点),PCR扩增获得一条276 bp和一条141 bp的两个小片段.以此为基础,利用长引物延伸和套叠PCR的方法,定点突变剩余5个位点,最后拼接获得W型PRSV-VPg基因.结果表明通过上述方案可以成功改造P型PRSV-VPg基因,获得与W型朋PRSV-VPg同源的目的基因,成功率为100%.该技术可以绕开传统的通过寻找毒源进行RT-PCR方法和人工合成方法获得病毒基因,其技术操作简单,且节约时间和成本,并在人工合成基因、多位点基因定点突变等方面具有很好的借鉴作用和应用价值.     

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法

目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。     

枯草杆菌蛋白酶E基因多位点定点突变库的构建及其筛选

利用化学合成的15个寡聚核苷酸片段作为诱变引物,同时对枯草杆菌蛋白酶E(Subtilisin E或Apr E)基因进行体外突变,获得了合全部突变位点各种随机组合突变的突变库,通过点杂交法和DNA序列分析肯定了该突变库的可靠性.从突变库中选择一单点突变(Met222Ala)和3点突变(Asn76Asp/Asn109Ser/Ile205Cys)的基因进行克隆、表达和产物的酶学性质研究,发现其抗氧化性和热稳定性分别比野生型的有显著提高,与文献报道的一致.表明了该突变库在枯草杆菌蛋白酶工程研究中的应用价值.     

枯草芽胞杆菌突变株ZC-7中性蛋白酶催化区域氨基酸突变导致其活力提高

目的：探讨枯草芽胞杆菌突变株ZC-7高产中性蛋白酶的原因。方法：用PCR方法分别扩增突变株ZC-7与出发菌株枯草芽胞杆菌AS1．398产中性蛋白酶的编码基因,测序比较二者基因的不同;在CPHmodels Server网站进行氨基酸序列分析,模拟突变前后中性蛋自酶的二级结构。结果：对比结果显示成熟肽中有5个氨基酸位点发生突变,其中3个位于酶的催化区域内;从预测的二级结构模型上可以看到突变位点所处区域的折叠结构发生细微变化。结论：先前研究中发现枯草芽胞杆菌AS1．398和突变株ZC-7发酵液中的酶蛋白含量基本相同,因此推测高产的原因不是酶量的增加,而是突变的氨基酸使酶与底物结合的部位更加适合催化水解反应,从而提高其比活力。     

MutPrimerDesign:用于人类基因编码区域突变位点的引物设计程序

位于基因编码区的DNA突变与基因的功能密切相关。在已知人类基因编码区的突变位点时,如何在基因组上设计引物验证该突变是一个重要的问题。本文利用Python语言开发了引物设计程序MutPrimerDesign。MutPrimerDesign通过解析人类基因组序列数据库以及基因注释信息,转换基因编码区坐标为基因组坐标,并调用Primer3的python程序包接口,可批量自动化完成基因突变位点的引物及探针序列设计。MutPrimerDesign使用简便,可识别多种数据库的基因名称,并能够修改引物常规参数,实现引物的快速调整。     

以P型PRSV-VPg为模板多位点突变获得W型PRSV-VPg的研究

以P型脉PRSV-VPg（Papaya Ringspot Virus,VPggene）基因为模板利用高保真酶通过两对引物（突变4个位点）．PCR扩增获得一条276bp和一条141bp的两个小片段．以此为基础,利用长引物延伸和套叠PCR的方法,定点突变剩余5个位点,最后拼接获得形型PRSV—V段基因．结果表明通过上述方案可以成功改造P型PRSV-VPg基因,获得与W型PRSV-VPg同源的目的基因,成功率为100％．该技术可以绕开传统的通过寻找毒源进行RT－PCR方法和人工合成方法获得病毒基因,其技术操作简单,且节约时间和成本,并在人工合成基因、多位点基因定点突变等方面具有很好的借鉴作用和应用价值．     

心脏肌球蛋白重链基因c.1273G〉A突变与肥厚型心肌病的关联分析

为研究中国人家族性肥厚型心肌病(HCM)的致病基因突变位点,分析基因型与临床表型的相互关系,文章在1个中国汉族HCM家系中进行心脏肌钙蛋白T(TNNT2)基因、心脏肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)基因和心脏β-肌球蛋白重链(MYH7)基因的突变筛查,聚合酶链式反应(PCR)扩增基因功能区外显子片段并对PCR产物进行测序分析.结果表明:在该家系接受调查的7名成员中有4名成员携带MYH7基因c.1273G>A杂合突变,该突变位点位于MYH7基因的14号外显子并使425位的甘氨酸(Gly)转换为精氨酸(Arg).该突变首次在国内HCM家系中发现,突变携带者的临床表型在家系内部呈现明显的异质性.该家系成员TNNT2及MYBPC3基因未发现突变且正常对照组相同位置未发现异常.MYH7基因是我国家族性HCM的致病基因之一,携带c.1273G>A突变的肥厚型心肌病患者临床表型差异明显,提示可能有其它因素参与了肥厚型心肌病的发展过程.     

斑马鱼反转录病毒插入突变技术的发展及其在基因饱和突变与筛选中的应用

用于大规模基因突变与筛选的主要策略有化学诱变、插入突变、基因诱捕。插入突变是一种通过外源DNA整合的方式来获得突变体,并克隆得到对应突变基因的方法。运用反转录病毒介导的插入突变技术,在脊椎动物斑马鱼中已经获得了许多影响胚胎发育和细胞生长过程的突变体,并找到了对应的基因。基因诱捕技术也被运用于反转录病毒载体的构建。这套系统的建立使斑马鱼成为第一个有可能达到基因饱和突变和筛选的脊椎动物。     

金黄色葡萄球菌核酸酶基因的片段缺失与定点突变

金黄色葡萄球菌核酸酶R(SNase R)是金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase A)的一种类似物,具有与SNaseA相同的酶活性,与SNase A唯一不同之处是在N端多出6个氨基酸残基。为了得到完整的SNase基因并使其在E.Coli中表达,我们利用单链U模板—单引物突变法,将为6个额外氨基酸残基编码的18个氨基酸残基删除,其突变率可达90％。进而,完整的SNase A基因被重组入表达载体pBV221。细菌表达产物的PAGE分析结果指出,SNase A在E.coli中得到高效表达。与此同时,我们利用两个不同的引物在单链U模板上同时介导两种不同类型的突变(片段缺失、碱基取代)其突变率可达83％以上,这为进行多种类型的高效突变提供一个有用的方法。本文也对影响突变率的某些实验因素进行了讨论。     

人参多肽基因的酶法体外随机——定位诱变

本文报道了酶法体外随机——定位诱变人参多肽基因的原理和方法。该法把传统的随机诱变和现代的定位诱变融合起来,可灵活控制基因突变的随机性和定位性。我们用双脱氧末端终止法测定了三个突变株的结果证实了该法的合理性和可行性,     

一种改进的快速PCR定点突变技术

在基因工程与蛋白质工程研究中常常用到基因突变技术制备突变体,用于研究基因调控、蛋白质的结构与功能。本项研究在快速PCR定点突变技术的基础上,改进实验方法,简化实验步骤,以适用蛋白质结构改造研究的需要。建立的突变技术仅需一次PCR反应即可完成基因的定点突变,突变效率为79.6%左右。该法对1～3个连续碱基的突变和对间隔4个甚至多达15个碱基的数个密码子突变效果都很好。     

植物诱变技术的研究进展

植物诱变技术是指利用外界因素加快物种遗传变异,在短期内获得有利用价值的突变体,为培育新种质、新品种及基因功能的研究等创造条件。相对于自然的选择,诱变技术具有高频率、广突变、周期短等特性。主要论述了常用的化学诱变、物理诱变、空间诱变和生物诱变等诱变手段,并详细介绍了上述诱变技术的诱变机理、生物学效应、常用的诱变方式及其在植物应用中的研究现状。针对现行各种诱变技术的不足提出了今后努力的方向。     

A new approach to random mutagenesis in vitro

Random mutagenesis is a powerful tool for studying the effects of a large number of permutations of a particular DNA sequence and its encoded products. Here we describe a new strategy of conducting in vitro random mutagenesis using ethyl methane sulfonate (EMS). The Bacillus aprN18 gene, coding for a serine protease with fibrinolytic activity, was used as a target gene. To study the mutations of the coding region, rather than the whole plasmid, the 1.4 kb gene fragment was cut out from an expression plasmid and treated with 10 mM EMS at 37 degrees C for 1 h. The treated fragment was then ligated back into the original expression vector and a library of random mutants was constructed in a protease-deficient Bacillus subtilis strain. A plate assay-based screening method was used to select for mutant clones with altered enzyme activity, and the change of activity was then confirmed by a semi-quantitative enzyme assay using liquid culture supernatant. The inserts of five clones with altered enzyme activity were randomly chosen for sequencing analysis. Among the point mutations detected, GC --> AT transition accounts for 42.1%, AT --> GC transition 34.2% and GC/CG transversion 23.7%, respectively. To our knowledge this is the first application of EMS for in vitro mutagenesis of a defined DNA sequence.     

环境胁迫诱导的细胞适应性突变

细胞具有普遍的突变和进化能力, 如病原菌的抗药性、工业菌株的适应性和人体细胞的癌变等, 但是细胞的适应性突变是如何产生的呢？通过非致死性突变分析模型的建立与应用, 产生了新的适应性进化观点, 即环境胁迫诱导细胞适应性突变。这种环境诱导的细胞突变过程涉及多方面的生理调控, 包括细胞内毒性物质(如氧活性物质)积累并造成DNA损伤、DNA错配修复的活性受到抑制、胞内RpoS反应和SOS反应被激活等。这些反应使胞内高保真的DNA复制状态转变为低保真的DNA修复状态, 提高胞内突变率和重组活性。此外, 基因转录影响基因组的不稳定, 容易产生DNA损伤, 并造成局部的高突变率, 即形成了转录偶联的DNA修复与突变为基础的适应性突变观点。文章围绕环境胁迫诱导细胞突变率增加和转录偶联的DNA修复与突变这两种适应性突变分子机制, 阐述其相关的研究进展, 以期更好地理解环境条件诱导细胞发生适应性突变的过程。     

Identification by saturation mutagenesis of a single residue involved in the alpha-galactosidase AgaB regioselectivity

The -galactosidase AgaB of Bacillus stearothermophilus displays a major 1,6 and a minor 1,3 regioselectivity. The wild-type enzyme was subjected to directed evolution (random mutagenesis and in vitro recombination) using a double screening strategy based on the elimination of the 1,6 regioselectivity and the analysis by TLC of the transglycosylation products. One of the AgaB mutants (E500) exhibited a new 1,2 regioselectivity and a rather high level of transglycosylation. The corresponding gene contains 10 mutations compared to the agaB gene and we demonstrated by saturation mutagenesis that the G442R substitution strongly contributes to the emergence of this new regioselectivity. Moreover, other single point mutations at this position led to new mutants displaying other kinds of regioselectivity demonstrating the importance of this position in the subtle kinetic control of transglycosylation.     

A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants

A new reverse genetics method has been developed to identify and isolate deletion mutants for targeted plant genes. Deletion mutant libraries are generated using fast neutron bombardment. DNA samples extracted from the deletion libraries are used to screen for deletion mutants by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers flanking the targeted genes. By adjusting PCR conditions to preferentially amplify the deletion alleles, deletion mutants were identified in pools of DNA samples, each pool containing DNA from 2592 mutant lines. Deletion mutants were obtained for 84% of targeted loci from an Arabidopsis population of 51 840 lines. Using a similar approach, a deletion mutant for a rice gene was identified. Thus we demonstrate that it is possible to apply this method to plant species other than Arabidopsis. As fast neutron mutagenesis is highly efficient, it is practical to develop deletion mutant populations with more complete coverage of the genome than obtained with methods based on insertional mutagenesis. Because fast neutron mutagenesis is applicable to all plant genetic systems, this method has the potential to enable reverse genetics for a wide range of plant species.     

Inverse PCR-based site-directed mutagenesis of nucleotide sequences coding for carbohydrate-binding fragments of legume lectins

A new method of site-directed mutagenesis was developed to allow manipulation with extended plasmid-cloned gene fragments irrespective of their position and the presence of restriction sites. The method was used to obtain chimeric constructs encoding a Pisum sativum lectin with the native carbohydrate-binding region replaced by its counterpart from other legumes. The method can be used in plasmid construction to clone a coding gene fragment under the control of a promoter in a certain reading frame.