用于新型冠状病毒检测的核酸等温扩增技术研究进展

核酸检测作为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)筛查诊断和病情监测的主要手段,在疫情防控中发挥了重要作用。虽然实时荧光定量PCR被认为是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的金标准,但其依赖荧光定量PCR仪且扩增检测时间较长,难以实现现场快速检测。因此许多基于核酸等温扩增的SARS-CoV-2检测方法相继诞生。等温扩增对仪器温控要求不高,通过与微流控芯片和可视化检测技术结合,可进一步简化操作、降低成本,为SARS-CoV-2现场快速筛查提供有力的技术支撑。本文围绕已报道的SARS-CoV-2等温扩增检测方法原理、检测性能及优缺点进行探讨,为进一步发展SARS-CoV-2现场快速检测平台提供参考。     

简化核酸提取过程在病原体核酸检测中的应用现状和发展趋势

简化核酸提取过程相较于经典的试剂盒法和全自动核酸提取技术,凭借其简便的操作步骤、便携易用的仪器设备和简单的人员培训等优势在病原体核酸检测中得到广泛应用,为实现病原体核酸的快速检测和现场检测(Point-of-care testing,POCT)奠定了良好的基础。本文比较了不同的核酸提取方法,对简化核酸提取过程的方法学进行综述,讨论其在病原体核酸检测领域中的应用现状,并展望其发展趋势。     

科技信息

荧光定量PCR技术是一种先进的定量核酸检测分子诊断技术,在西方国家广泛用于乙肝HBV,丙肝HCV,艾滋病HIV,性病STD等传染病及肿瘤性疾病快速早期诊断,并作为一种先进手段用于多种生物学及医学研究,在我国现行禽流感诊断国家标准中也规定了要用该方法检测核酸确诊。荧光定量基因扩增PCR检测系统是实现荧光定量PCR技术的核心设备,目前国内主要依赖进口,价格大约是普通PCR仪的十倍。西安天隆科技有限公司通过与西安交通大学教育部生物医学信息工程重点实验室生物医学及分子光子学中心产学研结合,自主研发的荧光定量基因扩增PCR检测系…     

基于微流控芯片的等温扩增技术北大核心CSCD

基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的核酸扩增技术是分子诊断领域的金标准,然而PCR往往包含多个反应温度,涉及长时间的循环升降温过程,且需要在复杂热循环仪中完成,这些都限制了其在现场即时检测(point-of-care testing,POCT)中的应用。与传统PCR相比,等温扩增依靠恒定反应温度,反应时间短,检测装置简单,能够提供更加方便、快捷的核酸检测。基于微流控技术的等温扩增检测,通过兼顾微流控与等温扩增两者的优势,能够为POCT分子诊断提供更具竞争力的平台。例如,在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情防控中,多种形式的POCT等温扩增检测展示了其独特优势。文中首先归纳总结了典型的等温扩增技术及其检测方法,然后对不同类型的等温扩增微流控系统进行了分类总结与分析(如功能定位、结构组成、流体控制、系统特点等),最后总结了等温扩增微流控系统在新冠病毒(SARS-CoV-2)等不同病原体检测领域中的应用,并对等温扩增与CRISPR基因编辑等其他新型技术的相互结合进行了介绍与展望。     

PCR增强剂在核酸体外扩增检测技术的研究进展

在各种高致病性病原体、禽流感病毒、食源性微生物等引起的疾病随时大规模流行的背景下,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对第一例或第一波病例的快速实验室诊断显得尤为重要,同时发展出多种以PCR技术为基础的检测技术以便更加快速、高通量、敏感地对疾病进行诊断、预防或预测。然而,在实际病原体检测中,常常出现灵敏度低、准确性差的结果。PCR增强剂是在PCR及PCR衍生技术中添加的一类物质,其可从产率、特异性、灵敏度等方面提高核酸扩增性能,从而优化核酸检测,解决病原体检测的应用瓶颈,为第一例病原体检出节约宝贵的时间。结合以PCR为基础的核酸体外扩增检测技术对PCR增强剂在其中的应用、优缺点、作用机理进行介绍,以期为病原体核酸检测的实际应用提供一些参考。     

超快脉冲控制PCR（upPCR）技术及应用

在精准医疗、个性化医疗的大背景下,分子诊断在病原体检测、肿瘤诊断、优生优育、环境保护、食品安全等领域的应用越来越广泛,并逐渐向操作简单、快速准确、低成本、适用于基层及家庭使用的分子即时检测（point-of-care testing,POCT）方向发展。超快脉冲控制PCR（ultra-fast pulse-controlled PCR,upPCR）是实时荧光定量PCR（qPCR）技术的延伸和升级,该技术利用能量脉冲控制扩增反应中的金属加热元件（主要是纳米金）,在几百微秒内完成溶液局部微环境的快速升温,实现模板DNA的解链变性,停止加热后反应微环境可被周围溶液快速冷却到聚合酶的延伸温度,实现引物退火和模板DNA的扩增,单个变性-扩增循环仅有1.5~5 s,远快于传统PCR（约90 s/循环）,从而能够极大地加快扩增反应速度。upPCR技术在保留了传统qPCR高灵敏度、高特异性和多重检测等优势的基础上,增加了超快速（低于15 min）、设备简单等新优势,非常适合用于基层检测等分子POCT场景。本文主要对upPCR技术的原理、设备、核心原料及在分子诊断中的应用进行综述,并对该技术存在的优缺点,以及未来的技术发展和应用趋势进行了讨论。     

轮状病毒检测技术

轮状病毒是人和动物急性腹泻的重要病原 ,对轮状病毒进行快速、准确的检测对于疾病监测和疫情控制极为重要。从病原学、免疫学以及基因检测三方面 ,总结了轮状病毒检测技术的发展状况 ,重点介绍了较为成熟的免疫学技术 ,最新发展的实时荧光定量PCR、核酸序列依赖的扩增等分子生物学新技术 ,并对未来轮状病毒检测技术的发展趋势进行了展望。     

综述与专论: 基于核酸适配体传感器的即时检测（POCT）技术

即时检测（point-of-care testing，POCT）是一种检测成本低、检测速度快、准确度高、能自我采样获得临床诊断结果的新型诊断技术。该技术在临床诊断、病情监控与疫情防控等领域发挥了重要作用。核酸适配体是一种能够特异性识别多种靶标的分子探针，具有易合成、批间差异小、易实现信号放大等突出优势，是生物医学传感器中重要的分子识别元件。本文概述了核酸适配体探针的现有筛选方法和进展，总结了核酸适配体POCT传感器信号放大策略，着重介绍了各类核酸适配体传感器在POCT领域的应用现状，并对核酸适配体POCT传感器的发展前景进行了展望。     

多重环介导核酸等温扩增技术检测血液中常见病原体

背景：血液安全性筛查是输血前必要检测项目。目前临床采用血清学检测技术,存在较长的检测窗口期,易产生假阴性检测结果,造成输血交叉感染。目的：建立多重环介导核酸等温扩增技术,实现在一管反应体系内同时检测四种病原体：乙肝病毒,丙肝病毒,艾滋病毒和梅毒螺旋体。方法：通过限制性酶切处理多重环介导核酸等温扩增产物,利用酶切产物的长度分析扩增产物的种类,从而分析待测样本中含有何种血液病原体。结果：检测164例临床样本,其检测结果可以通过琼脂糖电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳及芯片电泳分析,且均可实现对多重扩增产物的酶切片段进行区分和鉴别。结论：多重环介导核酸等温扩增技术可以同时单管检测多种待测血液病原体,可以为临床提高简单、快速、高灵敏和高特异的检测技术。     

基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术

病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。基于PCR的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检测存在窗口期等问题,已成为目前最主要的病原微生物筛查方法。然而,对精确控温热循环仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用。虽然基于核酸等温扩增的病原微生物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖,但仍需要进行样本核酸分离提取、扩增与检测等步骤。近年来,微流控技术与核酸等温扩增技术相结合,诞生了多种病原微生物等温扩增微流控检测技术。该技术通过设计芯片结构、优化进样模式及检测方式,实现了病原微生物核酸提取、扩增与检测一体化,并具备多重检测、定量检测等功能,具有对仪器依赖度小、对操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点,适合于在多种环境下的病原微生物快速检测。本文从核酸等温扩增原理、进样方式、检测方式等方面对核酸等温扩增病原微生物微流控检测技术进行了综述,以期为病原微生物的快速筛查提供更多的方案思路,提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能力。     

等温扩增技术及其结合CRISPR在微生物快速检测中的研究进展

等温扩增技术因其对仪器依赖性低、核酸扩增高效等优势,非常适合于快速检测,已在微生物快速检测领域得到了广泛应用。本文从核酸提取、等温扩增(以环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)为例)和产物检测角度,就近年来核酸等温扩增技术的发展及其在病原微生物核酸快速检测领域的应用进行综述,并概述了核酸等温扩增技术与CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑技术相结合的最新研究成果,为这些新兴技术的研究和未来的发展提供新思路。     

用于高灵敏可视化检测松材线虫的闭管等温扩增法

建立了一种基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的松材线虫高灵敏可视化闭管检测方法。针对松材线虫核糖体DNA的序列保守区域设计LAMP引物,通过优化LAMP体系中的Mg2+、甜菜碱浓度和反应温度等因素,建立了环介导等温扩增法;并结合蜡封反应管对产物进行检测,检测结果可直接通过肉眼观察SYBR Green I荧光显色进行判定。结果表明,本方法可检测到低至10拷贝/管的松材线虫核酸片段,可对单条线虫进行检测,并且具有很高的特异性,能区分检测松材线虫与拟松材线虫。由于整个反应恒温进行,无需热循环仪;闭管检测极大地降低了扩增产物交叉污染的风险;检测速度快,整个检测过程只需40 min,为松材线虫的现场快速筛检提供了一种简便、高灵敏、高特异的工具。     

重组酶聚合酶扩增技术研究进展

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术,具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点。利用RPA技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列,结合侧流层析试纸条或荧光信号监测装置等简易实验设备即可直接观察检测结果。就RPA技术的原理、发展、技术特点及其近年来在体外诊断、病原检测等领域的研究进展作一综述,旨在为该技术的深入研究和应用提供参考。     

滚环扩增技术及其在生物分子诊断中的应用

滚环扩增技术(RCA)是近年来发展起来的一种新型的核酸扩增技术.该技术是基于连接酶连接、引物延伸、与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法.在恒温的条件下,可以产生大量的与环型探针互补的重复序列.与传统的核酸扩增方法相比,它具有扩增条件简单,特异性高,能在恒温条件下进行等特点.滚环扩增技术结合荧光、电化学、电化学发光等检...     

纸基微流体技术在即时检测中的应用

即时检测(Point-of-care testing,POCT)是在采样现场或病人旁边进行的一种检测方式,它利用便携式分析仪器及配套试剂进行检测,能快速得到结果,被广泛应用于体外诊断行业。其中纸基微流体检测技术以其成本低廉、操作简单、检测快速、设备便携、应用不受场所限制等优点在发展现场POCT技术中具有非常大的潜力。近年来,纸基微流体技术的发展及其与各种新技术、新方法的融合推动了POCT技术和方法的实质性发展。文中简要概括了纸的分类与特性,介绍了基于纸基微流体技术发展而来的样本前处理方法、反应过程中的液流控制方式、反应后检测结果的读取与分析手段,综述了近年来在面向POCT应用中各类基于纸基微流体的分析装置(Microfluidicpaper-basedanalyticaldevices,μPADs)的研究进展,最后对纸基微流体技术在POCT应用中存在的问题进行了讨论,并对未来前景作了展望。     

LAMP-LFD技术及其在生物快检方面应用

LAMP-LFD技术是环介导横温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification)与横向流动试纸条(Lateral flow dipstick)相结合的一种新颖的检测技术,该技术将核酸横温扩增和可视化试纸条检测有机地结合。环介导等温扩增技术(LAMP),只需要在恒温(60℃~65℃)条件下保温几十分钟,即可将所需目的基因扩增到109水平。横向流动试纸条(LFD),融合了免疫层析技术和分子生物学手段,能在纸条上形成有颜色的检测线从而可以特异性地检测出该目标产物。环介导横温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)相互结合的技术,使LAMP扩增产物现场检测可视化,检测结果明显直观,通过肉眼即可辨认,并具有高特异性、高灵敏度、简便、安全及成本低的特点,一度引起科研工作者的广泛关注。综述了环介导横温扩增方法与横向流动试纸条相结合(LAMP-LFD)技术的原理、优势、及其在生物快速检测方面的应用等,并指出了LAMP-LFD技术目前存在的不足以及展望。     

多重核酸检测技术研究进展

核酸检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点,被广泛应用于细菌、真菌、病毒、寄生虫的快速检测和鉴定,以及疾病的早期筛查与诊断中。随着生物检测技术的发展,基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用,主要包括以多重PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术,这些技术可对多个靶标进行同时检测,具有快速、高通量、样品消耗少等特点。本文扼要介绍这些技术的原理,及其在病原检测、疾病诊断等方面的应用。     

等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

近年来,新型传染病相继爆发,如严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）、H7N9禽流感等,严重威胁着人类健康和社会、经济的可持续发展,同时给传染病的防控带来了严峻挑战。病原体检测是传染病防控的重要环节,越来越多的新技术被应用其中。等温核酸扩增技术作为一种快速、灵敏度高的病原体检测技术,已取得了长足发展。对等温核酸扩增技术的原理、重要特性及其在病原体检测中的应用进展进行了较为全面的综述,以期为这一技术的推广和应用提供重要参考。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA

目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法。方法：利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5＇端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价。最后收集15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果：试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250copies/mL。在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。结论：核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用。     

核酸试纸条检测方法研究进展*

凝胶电泳、实时荧光PCR等常规核酸检测方法存在操作繁琐、设备昂贵、反应时间长等局限性。随着核酸检测市场规模的大幅提升,常规检测方法已无法满足临床诊断、检验检疫的需求。核酸试纸条(nucleic acid detection strip,NADS)是一种新兴的核酸检测方法,具有灵敏度高、操作便捷、结果可视化、成本低且耗时短等优势,在基础研究与临床诊断等领域受到广泛关注。综述近年来NADS的检测方法及研究进展,系统总结该技术的原理、应用及临床潜在转化价值,以期为NADS的进一步开发、利用提供借鉴。