噬菌体重组酶介导的DNA同源重组工程

来源于噬菌体的遗传操作工具在基因工程中具有非常重要的地位,例如位点特异性重组酶、柯斯质粒DNA文库及同源重组酶等。其中,来源于Lambda噬菌体的同源重组酶Redα/Redβ和来源于Rac原噬菌体的同源重组酶RecE/RecT能够高效地介导35–50bp短同源臂之间的重组。基于噬菌体同源重组酶Redα/Redβ和RecE/RecT开发的DNA同源重组工程(Recombineering)能够对靶标DNA分子进行快速、精准、高效的修饰,不受限制性内切酶识别位点和DNA分子大小限制,已发展成为一种新型的基因工程技术。本文主要综述了噬菌体同源重组酶及其作用机制、在大肠杆菌及其他细菌中的应用和开发,以及在微生物次级代谢产物的挖掘、动植物转基因、病毒基因组克隆和修饰等方面的应用。原位激活沉默基因簇需要宿主特异性的DNA同源重组工程进行启动子和调控元件的修饰;异源表达次级代谢产物的首要步骤一般是通过RecET直接克隆大的DNA片段;动植物转基因复杂载体的构建效率在有了Red同源重组系统以后有了革命性的发展;RecET直接克隆和Red同源重组介导的感染性克隆构建和修饰方法,不仅有利于病毒基因组功能研究...     

复幼促进核桃不定根发生的DNA甲基化机制探讨

该研究以核桃的复幼和成龄插穗为材料,通过甲基化修饰依赖性内切酶测序技术(MethylRAD-Seq),在全基因组水平上检测成龄与复幼插穗中DNA甲基化位点分布特征,进一步对复幼处理前后插穗中差异甲基化位点相关基因的表达情况进行分析。结果显示:(1)复幼处理可显著降低核桃插穗的DNA甲基化水平。(2)功能富集分析结果显示,差异甲基化位点相关基因主要参与油菜素内酯信号转导、次级代谢产物生物合成和木质素生物合成等功能,参与光合作用、MAPK(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路、果糖和甘露糖代谢、cAMP(cyclic AMP, CAMP)信号途径和苯丙烷生物合成等代谢通路。(3)qRT-PCR分析结果显示,复幼处理前后,不定根发生的关键调控基因NAC1、ARF5、ARF6和WRKY22在复幼和成龄材料中具有不同的表达模式。研究认为,复幼处理降低了核桃插穗中基因组DNA的甲基化水平,进而影响不定根发生过程关键功能基因的表达,可能是复幼调控核桃不定根发生能力的重要途径。     

一株新分离的肠杆菌噬菌体的快速遗传鉴定及其宿主识别基因的快速克隆

以大肠杆菌8099为宿主自医院污水中分离出一株肠杆菌噬菌体IME08,其遗传物质经RNA酶、DNA酶处理证实其为DNA,用限制性内切酶处理该DNA证实其为双链DNA。利用随机引物PCR技术扩增并克隆该噬菌体基因组的随机片段,经测序后同源比对,判断该噬菌体是一株新的T4-like噬菌体。根据4株T4-like噬菌体 (T4,JS98,T2及K3) 宿主识别基因 (g37) 5'端的高度保守序列,采用随机PCR与巢式PCR结合的“基因组跳跃”策略快速克隆出了该噬菌体的宿主识别基因g37和g38。     

长半衰期重组人超氧化物歧化酶的研制及性质

一种双亲有机化合物聚苯乙烯马来酸丁酯(SMA)经酰胺键与重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu/Zn SOD)共价交联,制得修饰酶.当42%游离氨基被修饰时,保留酶活力为88%.酶蛋白主链结构在修饰前后变化不大.与天然酶相比,修饰酶的生物半衰期延长了22倍,抗蛋白水解酶能力亦有所增强.     

提高噬菌体裂解酶抗菌活性的研究进展

随着细菌耐药性问题的日益严重,人们开始寻求新型抗菌制剂。噬菌体裂解酶是一种由ds DNA噬菌体编码的水解酶,能高效特异性地裂解细菌细胞壁且不易使细菌产生耐药性。由于天然裂解酶具有宿主谱窄,不能裂解革兰阴性菌等缺点,研究者对裂解酶进行了大量的设计改造。本研究主要对提高噬菌体裂解酶抗菌活性的研究进展进行综述。     

RNF8/RNF168信号通路在DNA损伤修复中的作用

细胞内DNA会受部分外界因素(如紫外辐射,电离辐射和化学毒素)和内部因素(如复制错误)的影响而发生损伤,包括DNA双链断裂、DNA错配和DNA交链等。DNA损伤发生后,损伤部位会被一些蛋白识别,进而招募一系列蛋白至损伤部位,形成一个修复系统。DNA双链断裂是最严重的一种DNA损伤,错误修复往往导致疾病的发生。DNA双链断裂(double strand break, DSB)后,细胞启动RNF8/RNF168信号通路进行修复。RNF8和RNF168是这条通路的枢纽蛋白;53BP和BRCA1是关键的效应蛋白,决定着DSB修复的方式;组蛋白泛素化、磷酸化和甲基化等翻译后修饰是这条通路顺利进行的基本条件;染色质重塑、泛素化酶/去泛素化酶平衡和蛋白稳定性是这条通路的主要调节方式。本综述对RNF8/RNF168信号通路进行了梳理总结,希望其能对相关研究者起到参考作用。     

利用锁核酸化学偶联FokⅠ核酸酶靶向切割HBV基因的体外实验

乙肝病毒(HBV)是有缺口的双链DNA病毒,侵入人体肝细胞后形成共价闭合环状DNA(ccc DNA)持续复制,并在逆转录过程中随机整合入宿主基因组。慢性乙型肝炎感染者平均每个细胞中含有33个ccc DNA拷贝,半衰期长达35~57 d,很难从体内彻底清除。利用锁核酸抑制HBV转录,是乙肝治疗的新策略。此外,利用基因组编辑技术靶向切割HBV基因组,有望从源头治愈乙型肝炎。基于锁核酸与双链DNA形成三股螺旋的能力、抵御核酸酶及聚合酶的稳定性以及对单碱基错配的敏感性,本研究以靶向切割乙型肝炎病毒为例,设计构建锁核酸修饰的寡核苷酸作为DNA结合域,有效增强对靶基因的特异性识别;同时利用FokⅠ核酸酶分子量小、二聚化时才具有酶活等特点,设计构建FokⅠ切割域二聚体重组蛋白作为DNA切割域;进而通过双功能交联剂GMBS,建立了5′端氨基(-NH2)修饰的锁核酸与N端巯基(-SH)修饰的FokⅠ核酸酶定向化学偶联的方法,并在体外验证了新型工具对HBV基因的靶向切割。该方法为此后在体内进行高特异性、无整合风险的抗病毒基因治疗提供了全新的技术思路。     

5-甲基胞嘧啶在发育和分化中的作用

自从在小牛胸腺DNA中最早发现5-甲基胞嘧啶(~mC)以来,所有研究过的动物和植物DNA中都发现有这种稀有碱基。~mC并非随机地分布在DNA上,90％以上的~mC出现在CpG二核苷酸处。DNA的甲基化是在DNA复制以后由甲基化酶将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到胞嘧啶的5位上去而形成。脊椎动物DNA的甲基化模式具有遗传连续性。细菌和噬菌体DNA中,甲基化通常发生在腺嘌呤处,即N~6-甲基腺嘌呤(~mA)。然而在双鞭藻     

MAPPING重组噬菌体中插入片段的“分/合”策略

随着胚胎干细胞基因打靶技术不断推广应用,如何有效地从小鼠基因组DNA文库中筛选得到基因组DNA并进行结构分析(如限制性内切酶酶切图谱分析,即mapping等)已成为一个被普遍关心的问题.设计应用了“分/合”的策略,即先对重组噬菌体插入片段制备一套亚克隆,在对亚克隆进行详细的mapping的基础上,再对完整的大分子噬菌体DNA进行酶切分析,将两者相结合,可以分析得到完整的酶切图谱.应用此策略,简便准确地对所克隆的含有小鼠凝血因子IX基因组DNA的大分子插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,结果得到了DNA印迹等的验证.     

在玉米线粒体基因组内的叶绿体DNA序列

目前,研究家们发现除了在核基因中具有叶绿体DNA片段外,在许多种高等植物的线粒体基因组中也具有叶绿体DNA序列。采用限制性内切酶进行研究发现,在玉米线粒体基因组内至少存在三个重要的叶绿体DNA序列:(i)1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的大亚     

噬菌体T4诱导的脱氧核糖核酸(DNA)连接酶的分离和纯化

本文介绍一个从噬菌体T4诱导的大肠杆菌中纯化DNA连接酶的简法。这是从同一起始原料(噬菌体T4感染的大肠杆菌菌体)同时提纯三种酶(多核苷酸激酶,DNA连接酶及RNA连接酶)的步骤的一部分。这个方法包括以下几步：超声破碎菌体,抽提粗酶,用硫酸链霉素沉淀去除多核苷酸激酶和DNA．甩I)EAE纤素素(DE-52)柱层折将DNA建接酶与RNA连接酶分离开来,用磷酸纤维素(P-II)分步冼脱DNA连接酶,对在Tris-HCI,pH7.6中含50％甘油的缓冲液透析加以浓缩。最终得到高浓度(5500单位／毫升)和高纯度酶制品。     

霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列的测定与分析

测定并分析了霍乱弧菌噬菌体VP2基因组序列,为VP2生物学特性和功能研究提供分子遗传学基础。为此构建了VP2DNA随机文库,鸟枪法(shot-gun)测定其全基因组序列。测序结果用软件Phrad-Prap拼接成最小重叠群(contig),引物步移法测定contigs问的缝隙(gap)序列,拼接后获得VP2全基因组序列。利用生物信息学技术分析’VP2基因组,最后对VP2和相关噬菌体做DNA聚合酶(DNA pol)基因的进化树分析。结果：VP2属短尾噬菌体科,基因组全长39853bp,为环状双链DNA,G C含量为50．56％,较高于霍乱弧菌测序菌株N16961基因组G C含量;VP2的基因组有碱基使用偏性;预测和注释了45个开放读码框(ORF),分析了DNA复制基因、衣壳蛋白和DNA包装基因、侵染相关基因。DNA pol进化树比较结果,VP2与链球菌噬菌体Cp-1和芽孢杆菌噬菌体GA-1分为一群。根据对VP2基因组序列的测定和分析预测了VP2的ORF,并分析了其中的功能基因,推测VP2在进化关系上属于噬菌体phi29样噬菌体。     

小单孢菌40027菌株噬菌体的分离及其生物学特性的研究

以福堤霉素A产生菌──小单孢菌40027菌株为指示菌,从土壤中分离得到三株噬菌体:ΦHAU7、ΦHAU9和ΦHAU11。三株噬菌体的寄主专一性较强,在测试的15株放线菌菌株中,三株噬菌体能感染小单孢菌40027菌株和A-M-01菌株,ΦHAU9和ΦHAU11还能感染蔷薇小单孢菌(Micromonospora purprea)。三株噬菌体都是由多面体的头部和尾部组成;形成噬菌斑时培养基中适宜的Ca2 、Mg2 浓度分别为32mM和30mM;ΦHAU7在储存液中适宜的pH范围为6~12,而其它两株噬菌体的适宜的pH范围为6~10;在储存过程中三株噬菌体适宜的温度范围为28~37℃,经60℃保温30min后,除ΦHAU7仍有53%活力之外,其它两株噬菌体全部失活。限制性内切酶酶切结果表明:三株噬菌体基因组DNA均为双链DNA;基因组大小分别约为60kb、58kb和55kb。高压脉冲电泳结果揭示:三株噬菌体基因组DNA均具有粘性末端。     

溶酶体酶的甘露糖6磷酸化调控B细胞功能

<正>细胞对于抗原加工和呈递以及细胞内大分子的降解都依赖于溶酶体酶的活性。新合成的溶酶体水解酶会通过6磷酸甘露糖(M6P)残基来修饰其N端-连接的寡糖,修饰后的溶酶体酶能被高尔基体的M6P特异性受体识别,从而转运至内吞体或溶酶体,而不是经过分泌途径排出细胞外。临床中患有II型粘多糖症(MLII)的病人缺失磷酸转移酶的活性,这类病人自身不能进行M6P的修饰,病人体内多种溶酶体酶发生错误的转运以及过度分泌,导致溶酶体发生功能性紊乱。为了研究在缺失磷酸转移酶时,免疫系统中溶酶体酶靶向效率是否存在不同,本文的研究人员建立了MLII小鼠,来模拟临床中II型粘多糖症这     

乳酸乳球菌乳脂亚种W56中质粒pJW566的生物学特性

从丹麦乳酪发酵启子乳酸乳球菌乳脂亚种 (Lactococcuslactissubsp .cremoris)W56中 ,分离到一个 2 2 4kb的质粒pJW566,将该质粒转化到无质粒且噬菌体敏感的L .lactisMG1 61 4、SMQ86菌株中 ,所得转化子对常见 963、c2和P335属的噬菌体具有一定抗性。经测定噬菌体以及含有pJW566的菌株所繁育的噬菌体效价 ,发现该质粒对外源DNA具有限制和修饰 (Re strictionandModification ,R M)作用。将pJW566转化到一株噬菌体敏感的乳酪工业生产菌株L .lactisCHCC2 2 81 ,在牛奶发酵中 ,表现出较强的噬菌体抗性。体外内切酶活性测定表明 ,该质粒具有的限制性内切酶需要Mg2 +和ATP ,而AdoMet(S adenosylmethionine,AdoMet)对酶活有促进作用     

裂解型布鲁氏菌噬菌体的分子特征研究

目的:研究布鲁氏茵噬茵体Tb(Tbilisi)的形态学和分子生物学特征.方法:采用透射电镜观察噬茵体颗粒形态,双层琼脂法观察噬斑形态,梯度密度离心纯化噬茵体颗粒,提取噬茵体基因组,采用多种限制性内切酶(S1,DNase I,RNase A,BamHI)对基因组进行酶切琼脂糖凝胶电泳,SDS-PAGE观察噬茵体颗粒全蛋白片段.结果:Tb噬茵体电镜下显示头部直径为57±2nm,短尾(32±3mm长),分类学属于短尾噬茵体科.培养48小时后显示清晰噬斑,大小为2～3mm.核酸结构分析均表明Tb噬菌体基因组为线性dsDNA分子.基因组DNA经限制性内切酶BamHI酶切产生2条清晰条带,分子量在34.5kb左右.SDS-PAGE全蛋白电泳显示Tb噬菌体含有9条主要结构蛋白.结论:该研究证实了Tb噬菌体属于短尾病毒科噬菌体,对宿主菌存在裂解效应并产生2～3mm清晰透亮形态的噬斑,基因组为dsDNA分子,全蛋白包含9条主要的结构蛋白.该研究结果为布鲁氏菌噬菌体的分子水平的研究提供了新的研究基础.     

8株动物源编码Stx2短尾噬菌体的生物学特性

[目的]对8株源自大肠杆菌O157编码Stx2毒素的噬菌体生物学特性进行研究.[方法]丝裂霉素C诱导8株大肠杆菌O157菌株释放噬菌体,采用PCR作初步鉴定,分离、纯化噬菌体基因组,随机引物法地高辛(DIG)标记stx2基因片段作为探针,对纯化的噬菌体采用Southernblot进行Stx2噬菌体再次鉴定,透射电子显微镜观察纯化的8株Stx2噬菌体的形态特征,通过限制性内切酶图谱分析,确定噬菌体的核酸类型和基因组大小、以及限制性内切酶酶切片段多态性,并分析噬菌体的蛋白质组成特征.[结果]Southern blot证实分离的8株噬菌体为Stx2噬菌体,电镜下观察的各株Stx2噬菌体形态一致,头部均为正六边形,尾部很短,属于短尾噬菌体科,各株噬菌体之间存在相同的蛋白结构模式,基因组为双链DNA,限制性内切酶片段长度表现出一定的多态性,噬菌体的基因组大小从48.0-65.3 kb不等.[结论]来源不同菌株的8株编码Stx2噬菌体均为短尾噬菌体,其蛋白结构模式一致,但基因组具有不同组成.     

CRISPR/Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的改造使其成为继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术, 与ZFNs和TALENs相比, CRISPR/Cas系统更简单, 并且更容易操作。文章重点介绍了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的基本结构、作用原理及这一技术在基因组定点修饰中的应用, 剖析了该技术可能存在的问题, 展望了CRISPR/Cas系统的应用前景, 为开展这一领域的研究工作提供参考。     

DNA损伤响应信号通路与蛋白质翻译后修饰

DNA损伤响应涉及到损伤的感应、信号的传递、DNA修复等一系列通路和过程。在这些过程中,有大量蛋白质以其不同的修饰状态参与其中。有些蛋白质的修饰参与信号的识别和传递;有些修饰改变酶的活性;而有些修饰则参与调节,有大量的研究者对参与DNA损伤相关蛋白的功能及修饰进行了研究。它们在DNA损伤响应分别发挥着不同的功能,其协同作用使细胞得以从细胞周期关卡中恢复,进入正常周期。有大量研究者对参与DNA损伤相关蛋白的功能及其修饰进行了研究。在本综述中我们将从DDR所涉及的信号通路角度,主要对DDR及DNA损伤修复途径中所涉及到的蛋白质及其修饰进行总结。     

噬菌体PaP3末端酶大亚单位的克隆表达

末端酶 (terminase)是双链DNA病毒包装过程中 ,将病毒基因组多串联体 (concatemer)与病毒前衣壳连接 ,切割并转移单拷贝基因组进行前衣壳 (procapsid)的异源寡聚体 ,由一个大亚单位及 1～ 7个小亚单位组成。大亚单位具有ATP酶和核酸酶活性 ,在全酶活性中起到重要的作用。由我室分离并完成测序的绿脓杆菌噬菌体PaP3(GeneBank序列号 :AY0 78382 )为双链DNA病毒 ,其中4 0 6 93 4 2 14 1基因编码末端酶大亚单位。本研究采用PCR技术从噬菌体PaP3基因组中扩增出编码噬菌体PaP3末端酶大亚单位的目标片段 ,将目标片段插入原核表达载体 pQE…