IVF-20培养液用于大鼠体外受精的实验研究

目的探讨人用体外受精液用于实验大鼠体外受精的可行性,为实验大鼠的胚胎保种提供参考。方法选用人体外受精IVF-20培养液作为大鼠精子获能和受精培养液,对SD、Wistar、GK、F344等四种不同品系的实验大鼠进行体外受精;用mR1ECM培养液对体外受精所得胚胎进行体外培养实验。同时,将所得2-细胞胚胎移植给经假孕处理的受体鼠。结果四个品系大鼠体外受精后的卵裂率分别可达83.2%、72.6%、87.8%和71.6%。体外受精卵裂胚能够在体外进一步发育,SD大鼠囊胚发育率为16.7%,与体内受精胚胎在体外培养的囊胚发育率(24.5%)差异不显著。80枚2-细胞胚胎移植给2只受体鼠后均妊娠成功,产下正常仔鼠10只,产仔率12.5%。结论用于人体外受精的IVF-20培养液同样适合于实验大鼠精子的体外获能和受精,可以在多种品系获得较高的卵裂率,所得卵裂胚能够在体外发育到囊胚,并且所得卵裂胚在移植给受体鼠后能够产下正常仔鼠。     

还原型谷胱甘肽在AG129小鼠生物净化及快速繁殖中的应用

目的 AG129小鼠自然产仔困难,采用常规体外受精试剂无法获得足够数量用于移植的胚胎。使用还原型谷胱甘肽(GSH)调节小鼠体外受精液成分,完成对AG129小鼠体外受精,为体外受精困难品系的基因工程小鼠生物净化及快速扩繁提供思路。方法设计3个含不同浓度GSH的精子获能及受精液的实验组,浓度分别0. 5、1、2 mmol/L,1个不含GSH的精子获能液及受精液的对照组,每组超排5只小鼠,重复3次。结果不同GSH实验组及对照组间平均受精率差异具有显著性(P 0. 05),在精子获能及受精液中GSH浓度为1 mmol/L时,AG129小鼠体外受精效果最佳,平均受精率为(43. 35±1. 76)%,胚胎状态良好。将获得胚胎移植受体小鼠,受体动物均妊娠并顺利产仔。结论体外受精液中的GSH浓度为1 mmol/L时,能够显著提高AG129小鼠体外受精效率,为类似体外受精困难品系的小鼠生物净化及快速繁殖提供解决方案。     

山羊体外受精的研究

通过在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加不同的血清和不同浓度的卵泡液 ,在体外成熟培养液中培养不同的时间 ,以及采用不同的精子获能方法来摸索效率较高的体外受精方法体系。在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加FCS、EGS及不同浓度的卵泡液 ,成熟培养时间分别为 16、2 0、2 4和 2 7h ,山羊新鲜精液用钙离子载体法和肝素法进行获能处理后用于体外受精 ,比较其体外成熟率和体外受精率。添加FCS、EGS和 2 0 %卵泡液组的成熟率无显著差异 ,显著高于添加 10 %和 3 0 %卵泡液组的成熟率 ;但添加FCS和EGS组的受精率显著高于添加10 %、2 0 %、3 0 %卵泡液组的受精率。培养 2 4h组和 2 7h组的成熟率显著高于另外两组 ,而培养 2 7h组的受精率显著高于其余各组。用钙离子载体法处理的山羊精子的顶体反应率和体外受精率显著高于肝素法。EGS可以代替FCS添加于成熟培养液中 ,对COCs的成熟率和受精率没有明显的影响 ,但卵泡液不能完全代替FCS的作用。培养时间为 2 7h ,精子用钙离子载体法处理获能后能得到较高的体外受精率     

大熊猫精液冷冻颗粒的解冻液研究

本研究主要探讨大熊猫(Ailuropoda melanoleucus)精液冷冻颗粒的解冻液。80年代,我们率先研制成功了大熊猫精子体外获能液,继又研究了大熊猫体外受精的培养系统,并     

体外生产胚胎技术

体外生产胚胎技术是胚胎工程技术的基础,其过程涉及到卵母细胞的体外成熟、精子获能和体外受精、胚胎的体外培养这三个方面。主要综述了卵母细胞体外成熟的影响因素、精子分离和获能的方法、早期胚胎体外培养的发育“阻滞”现象和体外培养体系,同时展望了该技术的发展前景 。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用DIG末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异(P<0.01),平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胚胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

Ⅰ型干扰素受体缺失小鼠体外受精实验研究

目的探索两种I型干扰素受体缺失对于小鼠体外受精的影响并对体外受精条件进行优化。方法对两种I型干扰素受体缺失小鼠(IFN-αR-/-、IFN-α/βR-/-)及背景野生型小鼠(C57BL/6)分别进行体外受精及胚胎移植,每组超排5只小鼠,3次重复,记录相关数据,分析干扰素受体缺失是否对小鼠体外受精存在影响。分别将两种I型干扰素受体缺失小鼠配子与C57BL/6小鼠配子进行体外受精杂交试验,每组5只小鼠,3次重复,探讨I型干扰素受体缺失对雌雄配子体外受精的影响。同时,优化体外受精条件,探索提高受精率技术方法,每组5只小鼠,三次重复。结果两种I型干扰素受体缺失小鼠平均体外受精率低于背景品系C57BL/6小鼠,组间差异具有显著性(P0. 05)。干扰素α受体缺失小鼠体外受精率高于干扰素α、β受体双缺失小鼠体外受精率,组间差异具有显著性(P0. 05)。两种I型干扰素受体缺失小鼠的精子与C57BL/6小鼠卵细胞体外受精率均高于其卵细胞与C57BL/6小鼠精子的体外受精率,组间差异具有显著性(P0. 05)。通过延长精子获能时间至1 h或在获能液及受精液中加入1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)能够提高体外体外受精率,相应组间差异具有显著性(P0. 05)。结论 I型干扰素受体缺失可能导致相应品系小鼠体外受精率降低,而且对卵细胞的影响较精子的影响更为显著,通过适当延长精子获能时间或改变获能及受精液成分,能够提高体外受精率。     

禁食时间对雌性长爪沙鼠免疫功能的影响

动物的免疫系统是防御细菌、病毒等病原体侵害的重要途径,对其生存很重要,而食物短缺是影响动物免疫的重要因素。前期研究发现,禁食3天可抑制雌性长爪沙鼠T细胞介导的免疫功能,而禁食时长可能在影响动物免疫中起重要作用。为此,本实验主要测定不同的禁食时间如何影响雌性长爪沙鼠的免疫功能,该问题的解决有助于理解它们在野外面临食物短缺时的生存状况。将55只成年雌鼠随机分为8组,分别禁食1 d、2 d 、3 d和自由取食,每种处理又分别注射磷酸缓冲液和植物血凝素（PHA）。结果发现,随禁食时间的延长,PHA反应（指示T细胞介导的免疫功能）逐渐受到抑制,胸腺和脾脏逐渐萎缩,表明禁食时间对长爪沙鼠的免疫功能影响显著。同样,随饥饿时间增加,长爪沙鼠的体脂、血糖和血清瘦素水平逐渐下降,并且与PHA反应呈正相关,但白细胞总数和皮质酮水平不受禁食时间的影响。结果表明,禁食时间长短能显著影响雌性长爪沙鼠的免疫功能,随禁食时间的延长,长爪沙鼠T细胞介导的免疫功能逐渐受抑制,这可能与体脂和葡萄糖含量下降有关,血清瘦素逐渐降低也可能是其免疫受抑制的原因。     

炔雌醚对内蒙古农牧交错带长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)家群大小和巢域行为的影响

为检验施用炔雌醚对农牧交错带长爪沙鼠家群大小与巢域行为的影响,于2006年5月至9月对内蒙古锡林郭勒盟锡林浩特市农牧交错区域分布的长爪沙鼠家群使用炔雌醚进行种群不育控制实验。分设投药区和对照区两个组别,分别于5月、7月与9月份采用1/4样圆面积有效洞口计数法,随机选取24个长爪沙鼠家群,调查对照区域和投药区内沙鼠的家群洞口数量以及家群大小。另在对照区和投药区,随机测定了30个沙鼠的家群活动范围,对比使用炔雌醚前后长爪沙鼠巢域平均半径和活动面积的影响。结果为:对照区家群平均洞口数58个,投药区仅23个,在炔雌醚投药区长爪沙鼠家群受炔雌醚影响,洞口数仅为23个,表明其对长爪沙鼠家群大小控制效果显著。投药区内长爪沙鼠家群密度在投药后连续下降,最大下降幅度较对照区家群密度低70%,表明炔雌醚对长爪沙鼠的家群密度影响较大,可显著降低长爪沙鼠家群密度(P<0.05)。炔雌醚对长爪沙鼠家群平均半径和活动面积的研究结果显示,施用炔雌醚后家群巢域半径与活动面积均显著缩小(P<0.05),与对照区巢域平均面积相比缩小15%、平均活动半径缩小30%。通过以上结果可得出:单独施用炔雌醚对控制野外长爪沙鼠家群以及降低长爪沙鼠巢域、活动面积效果显著。炔雌醚可有效降低农牧交错带长爪沙鼠种群数量和有效活动范围,这对于农牧交错带的鼠害防控,同时降低鼠源性疾病,包括鼠疫的传播都有一定的意义。     

猕猴精子优选及体外获能的研究

选择活率高的精子并进行体外获能是开展猕猴体外受精研究的必要程序, 是研究猕猴受精生物学的重要手段。本实验采用上浮法和Percoll 梯度离心法对猕猴精液进行了优选, 并对处理后的精子形态正常率、精子活率、密度及受精率作了比较, 发现二者差异不显著; 用dbcAMP 和咖啡因使精子获能, 发现只有两种获能剂同时存在才能使猕猴精子获能并使卵母细胞受精。结论为: 上浮法和Percoll 法都是有效的精子优选法, 对受精率的影响差异不显著; dbcAMP 和咖啡因在猕猴精子体外获能时缺一不可。     

长爪沙鼠血清雌性激素的比较研究

目的测定长爪沙鼠、NIH小鼠和SD大鼠的血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平,为研究长爪沙鼠的生殖和胚胎工程提供基础资料。方法用放射免疫分析法测定上述动物生产前后血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平,进行统计学处理和分析。结果不同阶段雌性沙鼠E2值差异无显著性(P>0.05),P值差异有显著性(P<0.01);E2值比较,处女期沙鼠与同期NIH和SD差异有显著性(P<0.01),而在经产期的动物间水平接近(P>0.05);P值比较,处女期沙鼠与NIH接近,与SD差异有显著性(P<0.01);而经产期沙鼠在三种动物中是最高的(P<0.01)。结论长爪沙鼠血清E2、P的含量具种属特异性,并随动物的生理发育时期而变化。     

环磷酰胺对长爪沙鼠精子畸形的影响

目的探讨环磷酰胺（CP）对长爪沙鼠精子畸形的影响。方法取长爪沙鼠随机分成正常对照组,CP组（低、中、高剂量组即剂量分别为20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg）,环磷酰胺经腹腔注射,连续注射5 d,药后30d麻醉沙鼠,剖腹取出两侧附睾制备精子悬液涂片,用甲醇固定10 min,用2%的伊红染色30 min,蒸馏水洗片,显微镜观察精子形态。结果低、中、高剂量组分别与正常对照组比较,长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P〈0.01）;低、中剂量组分别与高剂量组相比较,长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P〈0.01）;低剂量组与中剂量组比较,精子畸形率差异不显著（P〉0.05）。形态学观察显示：环磷酰胺对长爪沙鼠精子影响畸形类型主要为尾折叠、尾粗细/长短/扭曲和无钩。结论环磷酰胺对长爪沙鼠精子有一定的致畸率,且对长爪沙鼠精子尾部影响最大。在一定剂量内范围内,环磷酰胺对长爪沙鼠的精子致畸率无明显区别;当高于一定剂量,随着环磷酰胺用药剂量的增加,长爪沙鼠的精子致畸率也增加。     

长爪沙鼠IgG的纯化及抗血清的制备

目的 纯化长爪沙鼠血清IgG,制备兔抗长爪沙鼠IgG抗血清。方法 采用Hitrap Protein G亲和层析预装柱来纯化长爪沙鼠血清IgG;通过SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法对长爪沙鼠血清IgG进行纯度鉴定,免疫兔子制备抗血清。结果 7 mL长爪沙鼠血清纯化得到11 mg IgG;电泳和免疫印迹测定,IgG纯度大于95%;用纯化的IgG作抗原制备了兔抗血清,免疫双扩散测定效价达1∶32。结论 建立了长爪沙鼠血清IgG的纯化方法,制备了长爪沙鼠IgG抗血清,证实长爪沙鼠血清IgG和Protein G具有较高的亲和性。     

大沙鼠,子午沙鼠,长爪沙鼠腰带骨的研究

主要研究大沙鼠(Rhombomys opimus)、子午沙鼠(Meriones meridianus)、长爪沙鼠(Meriones unguiulatus)腰带骨的比较,研究材料共30只骨骼标本均为成体。从测量中发现,它们之间差异比较突出,其主要特点: 1.腰带骨指数大沙鼠小于50,而子午沙鼠和长爪沙鼠都大于50。 2.大沙鼠坐骨弓指数在100以上,长爪沙鼠90以下,子午沙鼠80以下。说明大沙鼠坐骨弓较深。子午沙鼠和长爪沙鼠骨盆联合指数都小于大沙鼠。     

用CTC荧光染色法检测添加肝素对牛精子体外获能的影响

本试验在TALP液中添加不同浓度(0、20、40、80μg.ml-1)的肝素对牛精子进行获能,用CTC染色检测精子获能状况,探讨肝素浓度及诱导时间(1、3、6、9h)对牛精子体外获能的影响。结果显示:随着肝素浓度的提高,精子获能效果增强,3 h达到最高,但添加80μg.ml-1的肝素精子的顶体反应率低于其他组。结果表明:在TALP液中增加高浓度的肝素对精子体外获能有促进作用,用高浓度的肝素获能处理3h后的精子进行体外受精可能会得到较好的效果。     

长爪沙鼠发情周期规律与判定方法

目的研究长爪沙鼠发情周期,揭示发情规律,优化判定方法。方法连续18 d采集50只长爪沙鼠阴道上皮脱落细胞涂片,采用角化细胞计数法研究长爪沙鼠发情周期规律。比较瑞氏染色、HE染色和直接镜检判定发情周期4个时相的优缺点。结果长爪沙鼠的发情周期有稳定型、不稳定型、假孕三种类型。其中稳定型占68.6%,发情周期为(106.3±35.0)h,可分为4个时相。4个时相角化细胞的比例分别为发情前期(13.5±7.8)%、发情期(86.7±9.9)%、发情后期(27.9±12.8)%和发情间期(3.3±2.8)%。结论角化细胞计数能准确地判定长爪沙鼠的发情周期及各个时相。直接镜检法能快速反映阴道脱落细胞的形态。     

长爪沙鼠线粒体DNA控制区全序列测定及分析

目的对长爪沙鼠线粒体DNA控制区全序列进行测定,并对其进行鉴定及进化分析。方法根据长爪沙鼠已知基因序列设计引物,采用PCR产物测序法,对所得的片段进行测序鉴定。结合已公布啮齿类动物D-loop区序列,分析其碱基组成、遗传距离、并基于最小进化法和UPGMA法构建系统进化树。结果获得长爪沙鼠D-loop区序列,其与家鼠、小家鼠和仓鼠平均同源性为58%;碱基组成分析显示,长爪沙鼠与啮齿类动物有相似的碱基组成和碱基偏离,其A-skew和G-skew分别为0.0047和-0.28。进化分析结果显示,长爪沙鼠与家鼠（0.35）、黑家鼠（0.38）和仓鼠（0.39）具有较近的遗传距离,其分化顺序为跳鼠、蔗鼠、长爪沙鼠、仓鼠、家鼠和小家鼠。结论本研究获得长爪沙鼠D-loop区全序列,确定了长爪沙鼠与仓鼠、家鼠、小家鼠及其它啮齿动物的进化关系,为长爪沙鼠进化研究、线粒体的结构和功能研究奠定基础。     

精子介导GFP基因在小鼠早期胚胎中的表达

利用 DIG 末端标记技术和免疫组化技术分析了小鼠精子体外结合内化外源DNA的效率。试验结果表明,不同小鼠个体的精子结合外源DNA的阳性率有明显差异（P<0.01）,平均为13%。利用考马斯亮蓝染色评价了小鼠精子顶体反应发生的情况,筛选出TYH培养液为较合适的体外受精液。利用小鼠体外受精技术,将体外转染GFP基因并获能的小鼠精子与成熟卵母细胞进行体外受精,受精卵进行体外培养,表达GFP胎的阳性率为4.7%。验证了精子介导制备转基因小鼠胚胎的可行性,并建立了利用精子载体法制备转基因小鼠胚胎的平台。     

冷驯化条件下长爪沙鼠血清瘦素浓度的变化及其与能量收支和产热的关系

为研究低温胁迫条件下长爪沙鼠的适应对策及瘦素对体重和能量平衡的调节作用 ,我们将 7只成年雌性长爪沙鼠在 5℃条件下驯化 2 1d ,另选 7只作为对照 ,对体重、血清瘦素含量、体脂含量、摄入能、基础代谢率、非颤抖性产热等进行了测定。结果发现 :1 ) 5℃条件下长爪沙鼠的体重没有明显变化 ;2 ) 5℃条件下长爪沙鼠的血清瘦素浓度和体脂含量均明显低于对照组 ,且瘦素浓度与体脂含量呈显著正相关 ;3) 5℃条件下长爪沙鼠的摄入能、基础代谢率和非颤抖性产热等显著高于对照。这些结果表明 :长爪沙鼠在低温条件下产热能力和自身维持能量消耗都增加 ,能量摄入因此而增加 ;瘦素参与了能量平衡和体重的调节 ,但没有直接参与产热调节     

Oct4基因在猪孤雌激活和体外受精早期胚胎中的表达特征

目的研究植入前胚胎发育重要基因Oct4在猪孤雌和体外受精胚胎中的表达特征。方法收集成熟卵母细胞、孤雌和体外受精2细胞、4细胞、8细胞胚胎和囊胚,做荧光即时定量PCR检测,以体外成熟的猪卵母细胞做对照分析相对表达量。结果孤雌组和体外受精组胚胎在8细胞期Oct4表达量均最高(P<0.05),在孤雌和体外受精组囊胚相对于其他时期Oct4表达量最低(P<0.05)。在同一时期孤雌和体外受精胚胎上Oct4表达并没有差异。结论多能性基因Oct4在卵裂发育时期表达量动态变化,孤雌胚胎在一定程度上可作为体外胚胎基因表达的模型,且不同的胚胎培养条件可能导致基因表达的差异。