黄精实时荧光定量PCR内参基因的筛选

本研究采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-t Time PCR,q RT-PCR)筛选适用于黄精(Polygonatum sibiricum)的内参基因。利用黄精转录组数据库,筛选8个候选内参基因,18S核糖体r RNA基因(18S-r RNA,18S)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)、细胞色素基因(cytochrome,CYP)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin,TUA)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin,TUB)、多聚泛素酶基因(ubiquitin 5,UBQ 5)和(ubiquitin 10,UBQ 10)。应用q RT-PCR技术检测这8个候选内参基因在黄精不同组织器官中(根,根茎,茎,叶,花和种子)的表达情况。利用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价8个内参基因的表达稳定性。研究结果表明,TUB在黄精不同组织部位中表达稳定性最好,运用q RT-PCR技术研究黄精器官基因表达时,可选用TUB作为内参基因。确定黄精q RT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。     

翘嘴鳜per1 mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

为筛选生物钟核心基因per1表达定量中的相对稳定性最好的内参基因,本研究取翘嘴鳜成鱼心脏、肝脏、肾脏、脑、红肌、白肌、肠、眼和脾等九个组织为研究对象,选取GAPDH、18S rRNA、β-actin、rps29、RPL13a、B2M和EF1a为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对per1基因mRNA表达水平进行检测分析。研究结果表明18S rRNA和GAPDH的平均稳定值M最低,相对表达量最稳定。以18S rRNA和GAPDH为内参基因时分析发现per1基因表达量在肝脏中最高。本研究为在鱼类per1 mRNA表达检测过程中选用稳定的内参基因提供了实验和理论参考。     

基于表达谱芯片和下一代测序技术筛选先天性心脏病胎儿心肌组织差异表达的miRNA

目的 联合采用表达谱芯片和下一代测序技术同时高通量筛选先天性心脏病胎儿心肌组织表达差异的miRNA.方法 实验组为孕中期先天性畸形胎儿,对照组为同胎龄无心脏畸形的难免流产的胎儿,取胎儿心室心肌组织,联合采用Agilent Human 2.0 microRNAs表达谱芯片和SOLiD下一代测序技术同时观察心肌组织microRNA的表达变化,数据采用生物信息学方法进行分析,并用实时PCR方法验证芯片结果.结果 通过差异miRNA筛选,发现先天性心脏畸形组在表达谱芯片和下一代测序中共同差异的24个miRNA,生物信息学预测到1 606个靶基因,靶基因Gene Ontology分析表明其中与细胞进程、代谢过程、生物调控相关的靶基因为主,Pathway显著性分析表明,部分靶基因为生物信号通路中的关键因子;随机挑选共同表达差异的4个miRNA进行验证,结果表明定量PCR检测结果与芯片与下一代测序共同筛选结果基本相符.结论 这些在先天性心脏病中异常表达的miRNA为研究先天性心脏病分子水平上的发病机制提供了重要的线索,将有可能为心脏相关疾病的诊断和治疗提供新的靶点和研发新的药物.     

小鼠基因转录表达分析中内参基因的优选

目的 建立小鼠基因转录表达分析中内参基因的选择方法.方法 以C57BL/6J和C3H/HeJ两个品系3个不同组织及2个不同发育阶段为研究对象,应用反转录实时定量PCR技术,评价GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、HPRTl(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)、B2M(β2-microglobulin)、PPIA(peptidylprolyl isomerase A)、ACTB(Actin-beta)和18S rRNA(18S ribosomal RNA)等6个看家基因在下丘脑、垂体与卵巢中mRNA水平的表达稳定性.结果 GeNorm统计分析表明,GAPDH和HPRT1表达最为稳定,PPIA等次之,B2M在不同组织和发育阶段中都几乎无表达.结论 成功筛选到GAPDH和HPRT1两个稳定表达的看家基因,证实了小鼠基因表达转录分析中内参基因选择的必要性和可行性.     

MAPK信号通路基因在小鼠肝再生中的表达谱变化

为了分析丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPK)信号通路基因在肝再生中的表达图谱,以及探讨MAPK信号通路在肝再生中的作用,文章利用四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)诱导的小鼠肝损伤再生模型对MAPK信号通路基因的表达进行检测.首先,采用CCl4腹腔注射的方法建立小鼠肝损伤再生模型,通过肝脏切片HE染色和测定血清中谷丙转氨酶活性确认模型的质量,然后,在注射CCl4后的第0、0.5、1.5、4.5、7 d分别采集小鼠肝脏样本,应用Affymetrix公司的小鼠基因表达芯片,检测MAPK信号通路中93个基因的差异表达图谱,并用荧光实时定量PCR法验证芯片检测的结果.结果表明,在芯片检测到的93个MAPK信号通路基因中,有31个在肝再生中有不同程度差异表达,且经荧光实时定量RT-PCR检测的结果与基因芯片的结果相符合.基因表达谱芯片技术可以筛选出肝再生中差异表达的基因,在小鼠肝再生中的第0.5和1.5 d,MAPK信号通路中表达水平上调的基因增多,而在第4.5和7 d,则表达水平下调的基因明显增多.这一结果表明MAPK信号通路对肝再生不同阶段的双重调控作用.     

无患子RT-qPCR内参基因的筛选与验证

无患子根、茎、叶、花和果皮均含有生物活性物质三萜皂苷,为了解三萜皂苷生物合成途径中相关基因的表达水平,需要筛选稳定表达的内参基因。以无患子根、茎、叶、芽、雄花、雌花和不同发育时期的果皮为材料,根据无患子转录组数据,选择Sm18S,SmACT,SmTBCC,SmEF-1α,SmRPL1,SmRPS26,SmUBC12,SmUBP等8个基因作为候选内参基因。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测这些候选内参基因的表达量,并利用geNorm、NormFider和BestKeeper三个软件及RefFinder在线分析工具评价候选内参基因的稳定性。结果表明,8个候选内参基因的表达量在所有样本间的变化幅度存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件筛选出的最佳内参基因略有不同;综合分析结果表明SmACT、SmRPL1和SmUBP表达较为稳定,SmEF-1α稳定性最差;以SmACT、SmACT+SmRPL1组合和SmACT+SmRPL1+SmUBP组合为内参对三萜皂苷生物合成途径中的8个候选基因进行校准所得的表达量基本上保持一致,且相对表达量结果与转录组数据基...     

小桐子低温胁迫下microRNA实时荧光定量PCR内参的筛选与比较

选择合适的内参对实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果的准确性极其重要,在microRNA(miRNA)的qRT-PCR分析中尤为如此。通过筛选适宜分析小桐子低温胁迫下miRNA定量表达的内参,为小桐子及其他物种mi RNA的qRT-PCR分析提供有用的理论参考。基于以前的小RNA-seq结果,以低温处理的小桐子为材料,挑选11个候选内参基因,用实时荧光定量PCR技术检测它们在不同样本中的表达量,采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行表达稳定性综合分析。结果表明,表达最稳定的基因是miR6448和U6,miR6448的Ct值为23左右,表达丰度适中;U6的Ct值为10左右,表达丰度高;因此,miR6448可作为小桐子低温胁迫下表达丰度适中的miRNA qRT-PCR的内参基因;U6可作为小桐子低温胁迫下丰度较高的miRNA qRT-PCR的内参基因。     

利用表达谱基因芯片筛选溃疡性结肠炎差异表达基因

目的:利用人类全基因组表达谱芯片技术,分析溃疡性结肠炎患者和健康者基因表达谱差异,筛选出溃疡性结肠炎相关基因。方法:采用Trizol法提取8例溃疡性结肠炎患者和8例健康对照者结肠粘膜组织总RNA并纯化,逆转录合成c DNA,利用荧光染料Cy3标记aa UTP,转录合成标记的c RNA,并与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选出相关差异表达基因,采用DAVID在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,并对部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。结果:筛查出溃疡性结肠炎结肠粘膜组织差异表达基因4132个,其中上调基因2004个,下调基因2128个。选取6条差异表达基因进行PCR验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致。结论:溃疡性结肠炎患者与健康对照者基因表达存在明显差异,分析这些差异表达基因有助于我们探索溃疡性结肠炎的发病机制,为疾病的治疗提供理论依据。     

猪组织中miR-103实时定量PCR分析时合适内参的确定

定量实时PCR是miRNA表达检测的主要方法之一,而利用合适内参对定量实时PCR数据进行校正处理是确保该方法分析准确性的关键.为了确定猪正常组织中miR-103定量实时PCR检测分析的合适内参,首先采用geNorm算法和扩增效率试验对miR-196、U6 snRNA和总RNA 3个候选内参进行了评价;然后以miR-103的绝对定量结果为对照,比较分析了3个候选内参的校正准确性．结果表明,miR-196的表达稳定性和扩增效率均优于U6 snRNA和总RNA;以miR-196为内参的miR-103相对定量结果同绝对定量结果具有较高的一致性,两者均显示miR-103在猪大脑中高丰度表达,在胃、小脑、小肠、心脏、肝脏和胰脏中适度表达,在肺、脾脏和腿肌中轻度表达.这些结果说明,miR-196可作为猪正常组织中miR-103定量实时PCR相对定量分析的一个合适内参.     

日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽2基因的克隆与表达

为探讨鱼类抗菌肽基因的生物学功能,研究应用RACE方法克隆获得了日本鳗鲡 (Anguilla japonica) 肝脏表达抗菌肽2基因 (Liver-Expressed Antimicrobial Peptide 2,LEAP-2),即AJLEAP-2的cDNA序列,全长为450 bp,开放阅读框编码89个氨基酸。其成熟肽含有LEAP-2保守基序C-X5-C-X4-C-X4-C。AJLEAP-2基因组结构与其他脊椎动物LEAP-2相同,都包含有三个外显子。利用荧光定量PCR检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡不同组织/器官中的表达,发现其转录子在肝脏中表达量最高,是内参基因 (-actin) 的6倍; 其次是肠道,但其表达量仅为肝脏的1/130。此外,还检测了AJLEAP-2在日本鳗鲡玻璃鳗(Glass eel)阶段的转录表达水平,结果显示,玻璃鳗中AJLEAP-2的转录表达量仅低于黑仔期的肝脏,为黑仔鳗肠道表达量的2倍。LPS和迟缓爱德华菌 (Edwardsiella tarda) 刺激能显著上调鳗鲡血液中AJLEAP-2的转录表达,刺激16h后上调倍数最高,分别为对照组的86倍和12倍。此外,LPS刺激72h和E. tarda 刺激8h后,肠道中AJLEAP-2显著上调表达(P0.05),为对照组的8倍。Poly I:C刺激24h后,血液中AJLEAP-2转录表达显著下调。结果表明,AJLEAP-2在日本鳗鲡抗细菌感染过程中起重要的作用。     

应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因

以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料,使用油菜基因表达谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针),获得了4 410条差异表达探针,选择部分差异表达基因进行实时定量PCR,所得结果与芯片检测结果相吻合。其中,野生型较FS-M1显著上调且获得209个功能注释的探针,对应198个基因,这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子中;涉及较大的基因家族包括:细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。     

实时荧光定量PCR中内参基因的选择

实时荧光定量PCR技术是分析基因表达谱的一种常用方法,在分析中选择合适的内参基因对数据进行校正是得到可信数据的关键。以Lactobacillus helveticus H9为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,评价了5种常用内参基因ldh、recA、rpoB、gapdh和16S rRNA的表达稳定性,通过geNorm和NormFinder程序进行数据分析,结果表明5个候选内参基因在菌株不同的发酵时间点表达相对都较为稳定,结合两种分析得到其中最为稳定的基因是ldh,适合于用作后续实时荧光定量PCR试验中的内参基因。     

鳜鱼基因表达转录分析中的内参选择比较

目前基因表达的转录分析多采用单一或多个看家基因作为内参来校正目的基因的表达量。该实验以鳜鱼6个不同组织和5个不同胚胎发育阶段为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,观察了GAPDH、β-actin和18S rRNA三个看家基因mRNA水平的表达情况。geNorm统计分析表明,胚胎发育阶段β-actin表达最为稳定;不同的组织样品间,GAPDH表达最为稳定;而18S rRNA 的表达在不同的发育阶段不稳定。当利用多基因作为内参时,使用两个最稳定表达的看家基因即可对目的基因的表达进行准确校正。该结果证实了基因表达转录分析中内参基因选择的必要性,同时为鳜鱼等鱼类基因表达分析时内参基因的选择提供有价值的参考     

草鱼MYH mRNA表达量分析中采用的内参基因稳定性比较

本研究分别以β-actin、18S rRNA和GAPDH为内参基因,采用实时荧光定量PCR对草鱼早期发育时期肌球蛋白重链(myosin heavy light,MYH)基因的mRNA表达量进行分析,并比较不同内参基因对MYH基因mRNA表达水平检测结果的准确性.研究结果表明,以β-actin和GAPDH作为内参,MYH基因mRNA表达水平完全一致,其表达量从原肠到仔鱼阶段逐次递增,仔鱼与原肠期阶段相比表达量差异显著;当采用18S rRNA作为内参时,MYH基因mRNA在发育阶段的表达量呈不稳定状态.因此,β-actin和GAPDH均可作为内参基因,用于草鱼早期发育中MYH基因mRNA的相对定量研究:而18S rRNA作为内参时,可能会对检测结果造成偏差.本研究不仅准确的揭示了草鱼MYH基因mRNA的表达特征,并且为荧光定量PCR技术在鱼类基因表达研究方面提供了有价值的参考.     

松墨天牛化学感受组织荧光定量PCR内参基因的鉴定与筛选

【目的】本研究拟选择适合用于分析松墨天牛Monochamus alternatus化学感受组织中基因表达的内参基因。【方法】依据转录组测序结果进行内参基因鉴定,利用RT-q PCR技术分析内参基因在松墨天牛不同发育阶段和不同性别化学感受组织间的表达差异,并利用软件ge Norm,Norm Finder和Best Keeper比较其表达的稳定性。【结果】松墨天牛转录组中鉴定出9个候选内参基因(Actin,TUB,18S rRNA,RPS27A,RPS3,RPL10,AK,GAPDH和EF1A),其中后7个候选内参基因在松墨天牛中被首次鉴定,松墨天牛候选内参基因和其他昆虫相应基因的同源性很高。9个候选内参基因引物均具有良好的扩增效率,18S rRNA的表达水平最高,EF1A的表达水平最低;18S rRNA和Actin在不同样品间的表达水平差异最大,GAPDH和TUB表达水平在不同样品间差异最小。ge Norm和Norm Finder软件分析认为,GAPDH是最稳定的内参基因,TUB是较为稳定的内参基因,18S rRNA和Actin是最不稳定的内参基因;Best Keeper软件分析认为,GAPDH和TUB是合适的内参基因,18S rRNA和Actin是不适合的内参基因。最适合校正松墨天牛化学感受组织中基因表达数据的内参基因数量为2个,即GAPDH和TUB,并且这样的内参基因组合可以用于不同发育阶段和不同性别的不同化学感受组织。【结论】本研究结果为利用RT-q PCR技术准确分析松墨天牛和其他天牛基因包括化学感受组织基因相对表达量的内参基因选择提供了重要参考。     

小鼠不同组织及缺氧损伤后的大鼠心肌细胞中RIP3的表达

目的:检测小鼠组织中受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(RIPs)表达谱,并检测RIP3在大鼠心肌细胞缺氧损伤后的表达。方法:①采用荧光实时定量PCR分别检测RIPs家族基因在小鼠组织(心、肝、肺、肾、脑、小肠、骨骼肌、脾和主动脉)中的mRNA表达谱,并采用Western blot进一步检测RIP3在小鼠组织的蛋白表达谱。②将培养的大鼠心肌细胞分为缺氧组和对照组,缺氧组置于缺氧环境中培养48 h,采用western blot检测其中RIP3的表达变化。结果:①mRNA水平:RIP1 mRNA在脑组织中表达最高,心脏、肺、肾、骨骼肌较低;RIP2在心脏和肺表达量较其他组织高;RIP3在肠中表达较其他组织高出4倍以上,脑组织中未检测到RIP3表达;RIP4的表达以肺最高,而骨骼肌、脑和血管中表达量低。②蛋白水平:在小鼠组织中,RIP3表达以脑、骨骼肌中最高,心脏、肝、肺中表达较低。③培养的大鼠心肌细胞中,缺氧组心肌细胞的RIP3表达量显著高于对照组(P0.05)。结论:RIPs在小鼠组织中呈现差异表达,而在培养的大鼠心肌细胞缺氧损伤后RIP3表达升高。     

不同生存条件下东方田鼠肝脏基因表达谱分析

目的比较实验室条件下饲养的东方田鼠和野外捕捉东方田鼠肝脏的基因表达差异,寻找可能参与肝脏病变的关键基因。方法以实验室条件饲养的东方田鼠和野外捕捉东方田鼠为研究对象,分别抽提RNA,逆转录成cDNA,体外转录为cRNA并进行片段化;利用表达谱芯片分别进行杂交,扫描后筛选差异基因,并应用real-time PCR方法对部分基因的表达水平进行进一步测定,验证芯片数据的结果。结果实验室饲养东方田鼠肝组织与野外捕捉东方田鼠相比,共有99个基因和41个EST差异表达。其中参与机体代谢的基因占主导,约占35.4%;其次为参与信号通路的基因,约占24.2%;参与细胞周期和免疫的基因分别占6.1%和3.0%。结论利用基因表达谱芯片初步筛选了可能参与东方田鼠脂肪肝形成过程的基因,发现机体代谢通路的基因占主导,肝脏中细胞色素家族基因表达差异明显。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)FGF21基因克隆及其表达分析

采用RT-PCR技术从草鱼肝脏中克隆了成纤维细胞生长21(FGF21)基因序列,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)技术对该基因在草鱼幼鱼不同组织中表达进行了研究。结果表明,草鱼FGF21基因(Gen Bank登录号为MF_094727)c DNA序列全长615 bp,其中5'端非翻译区51 bp,开放阅读框564 bp,编码187个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,草鱼FGF21基因与斑马鱼同源性最高(78.86%),与犀角金线鲃、鲤、虹鳟、大西洋鲑、罗非鱼和日本青鱂的同源性分别为77.66%、73.94%、53.29%、52.41%、43.71%和35.96%,与人和小鼠同源性较低,分别为31.87%和30.39%。q PCR分析表明:FGF21基因在草鱼幼鱼肝脏、前肠、中肠、后肠、心脏、肌肉、肾脏和全脑中均有表达,在肌肉、前肠和中肠表达量最高,表明该基因可能在草鱼肌肉和肠道等组织发挥重要作用。     

日本血吸虫SjOST48基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫保护效果分析

为了鉴定日本血吸虫SJCHGC01743基因并评估其重组蛋白作为新的血吸虫病候选疫苗抗原的潜力,利用PCR技术扩增日本血吸虫SJCHGC01743基因,应用荧光实时定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的转录水平,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并诱导其在大肠杆菌中表达。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,利用Western blotting检测重组蛋白的免疫原性,应用间接免疫荧光技术对SJCHGC01743进行蛋白组织定位,利用间接ELISA方法检测小鼠血清中特异性抗体水平。将重组抗原免疫小鼠,评估其免疫保护效果。PCR扩增得到1 248 bp不含信号肽的c DNA序列,同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫寡糖转移酶OST48亚基,命名为Sj OST48。实时定量PCR分析显示Sj OST48在检测的童虫和成虫各个期别虫体中均有转录,其中在28 d虫体中的转录水平最高,在42 d雌虫中的转录量显著高于雄虫。构建的重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj OST48成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白r Sj OST48分子量约50 k Da。Western blotting分析表明r Sj OST48能被小鼠免疫血清识别,具有良好的免疫原性,间接免疫荧光实验表明Sj OST48蛋白主要分布于虫体体被,少量分布于实质。ELISA检测结果表明r Sj OST48能诱导产生较高的特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体。动物免疫保护实验结果表明Sj OST48能诱导小鼠产生32.62%(P0.05)的减虫率及57.61%(P0.01)的肝脏减卵率。本研究为深入探讨日本血吸虫Sj OST48基因的生物学功能及筛选新的血吸虫疫苗候选分子奠定了基础。