犬卵母细胞的体内成熟环境与体外成熟培养

犬(Canis familiaris)是生物医学研究的最重要模型动物之一.但由于生殖生理的特殊性,其卵母细胞的体外培养成熟率低,辅助生殖研究进展缓慢,严重制约了该动物在生物科学研究中的运用.在犬科动物体内,排卵前卵母细胞处于高浓度孕酮的卵泡环境中,在生发泡期排到输卵管内,并在此恢复和完成减数分裂.因此,犬卵母细胞体外成熟所需的条件不同于其他哺乳动物,目前主要采用以添加相关因子的M199作为培养液,但体外培养发育至MⅡ期的比率仅为15%～20%.所以,必须在了解犬卵母细胞体内成熟机制的基础上,建立一套类似于体内生理环境的体外成熟培养体系.本文在阐述犬卵母细胞体内成熟生理过程的基础上,对其体外成熟培养方法和影响因素的研究现状进行分析,为相关研究提供参考.     

牛卵母细胞体外成熟的研究

牛卵母细胞的成熟过程中,包括细胞膜、细胞质、细胞核的成熟。其中细胞质的成熟最为复杂。线粒体、皮质颗粒数量的变化和位移,脂滴类型的变化和形态改变,空泡形态学的变化等是鉴别卵母细胞幼稚、成熟和老化的重要特征。透明带随着培养而外侧疏松,内侧致密,母卵细胞膜上伸出的微绒毛为膨大泡状和细长毛状两种。在培养１４小时后颗粒细胞与透明带脱离联系。根据综合指标判定,１８小时这前为成熟生长期,１８￣２６小时为成熟期,     

褪黑素抑制小鼠卵母细胞的体外成熟

目的:探讨褪黑素(MT)对小鼠卵母细胞的体外成熟的影响.方法:通过卵母细胞自发、次黄嘌呤(HX)阻滞和激素诱导成熟三种体外培养模型研究了褪黑素(MT)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响.结果:①0.1 g/L、0.02g/L、0.004 g/L及0.0008 g/L浓度的MT均能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体(CEOs)自发成熟过程中第一极体(PB1)的释放(P＜0.01);②动力曲线分析表明,MT对自发成熟的CEOs的GVBD和PB1有显著的推后作用,与对照组相比,处理组的GVBD和PB1分别被推后8～10 h和3～4 h;③0.1 g/L和0.02 g/L两有效浓度的MT还能显著抑制促性腺激素(FSH)诱导的HX阻滞的CEOsGVBD的发生(P＜0.05),对PB1的排出虽有一定的抑制作用,但没有统计学意义;④MT和次黄嘌呤(HX)对CEOs的自发成熟有协同抑制作用(P＜0.01),但在裸卵(DO)自发成熟的阻滞中没有协同效应.结论:MT是调节哺乳动物卵母细胞成熟的重要激素之一,其作用机制可能是通过卵丘细胞实现的.     

马卵母细胞体外成熟的初步研究

采用抽吸法和切割法两种采卵方法收集马卵母细胞,显示采用切割法的卵母细胞回收率为83%,高于抽吸法的回收率46.5%(P＜0.05),在卵母细胞的成熟上,使用M199和DMEM/F12两种培养液为基础液的成熟体系,紧凑型(Cp)COCs和扩展型(Ex)COCs在以M199为基础液和以DMEM/F12为基础液的培养液中的卵母细胞成熟率分别为41.7%和64.7%、46.7%和66.7%,差异不显著(P＞0.05).两种培养体系中成熟的Cp COCs采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,在以M199和以DMEM/F12为基础液的培养液中成熟的卵母细胞的卵裂率分别为45%和57.1%,差异不明显(P＞0.05).     

卵母细胞成熟发生机制的研究进展

卵母细胞体外成熟培养已成为现代胚胎生物技术的重要内容之一,是体外受精、核移植等生物技术的重要环节。卵母细胞体外成熟受到众多因素的调控,其调控机制十分复杂。本文主要针对卵母细胞成熟过程中卵母细胞胞质成熟、核成熟及其主要调控因子等方面的发生发展机制进行总结。     

猪卵母细胞体外成熟的电生理学研究

本研究应用细胞内微电极记录方法、研究了猪卵母细胞体外成熟过程中膜电位的自发变化.猎卵母细胞在体外成熟培养前膜电位为-8.97±0.5mV;随着卵母细胞的逐渐成熟,膜电位绝对值首先增大(-46.40±1.7mV),然后逐渐减小,并发生极性倒转,由负值转变为正值(+10.60±1.0mV).随着卵母细胞的进一步发育,膜电位正值增大(+26.50±1.0mV).     

虹鳟卵母细胞体外成熟与授精的研究

随着基因工程技术的发展,很多学者正致力于转基因鱼的研究。就实验材料而言,鱼类有体外受精、发育,怀卵量多、卵径大、便于显微操作等优点。然而鱼类受精卵的卵黄多、核很小,镜下难以分辨。特别是虹鳟鱼卵膜厚而不透明不可能将外源基因精确地注入到动物极内。因此转化率很低,只有通过大量地注射鱼卵来增加转化个体的数量。这不但要饲养大量实验鱼,而且为受体鱼的检测带来了很大的困难。一般来说通过体外培养成熟的卵母细胞膜薄而透明,核膨大明显可见。因此可以精确地将外源基因注入核区域内从而可以大大地提高转化率。       

屠宰绵羊卵巢卵母细胞的体外培养成熟

[目的] 探索把屠宰母羊卵巢卵母细胞在体外条件下培养成熟的有效处理方法和条件以便为体外受精技术的研究提供更多的成熟卵子。 [方法] 把从屠宰母羊新鲜卵巢的发育卵泡中采集的784枚卵母细胞分为3种类型,即A型(卵丘细胞层较完整的卵子)、B型(卵丘细胞层部分脱落的卵子)和C型(卵丘细胞、放射冠均脱落的裸卵)。并     

兔卵母细胞体外成熟和体外受精的研究

用贴壁和悬浮生长二种培养系统,分析发情兔血清、滤泡液和激素对体外培养的兔卵母细胞的成熟、原核形成和发育能力的影响,并分析了不同浓度的激素对兔卵母细胞的作用。在贴壁生长的培养系统,滤泡液和激素对卵母细胞有明显的促成熟作用。但用这种卵母细胞体外受精,其原核形成率和发育率都较低。但在体外培养8小时后转移到体内受精,其原核形成和发育率大大提高,三者差别不大。在悬浮培养系统,卵母细胞成熟率、及体外受精后原核形成和发育率都远比贴壁生长的高,尤以原核形成率更甚。兔卵母细胞对激素的耐受力很小,以含FSH(2μg)、LH(1μg)、E_2-17B(1μg)和PRL组合的培波和含低hCG(7IU)的较适宜,高中浓度的FSH、LH和hCG都有促使卵母细胞变性和老化的作用。文中还讨论了二种培养系统不同的机制。     

斑马鱼卵母细胞的体外成熟及成熟卵的受精发育

采用体外培养的方法,研究斑马鱼卵母细胞的成熟过程。Ⅳ时相初级卵母细胞在o．5μg／m1 17a－羟基孕酮的EM－199培养液中,80％氧气,25℃的体外培养条件下,在40min内,胚泡(GV)逐渐由卵母细胞中央至动物极边缘l／2处移到动物极边缘,进八V时相卵母细胞。30min后胚泡破裂(GVBD),胚泡破裂率为59％。此种卵母细胞继续培养2h才完全成熟。成熟卵不能从滤泡膜中自然排出。冷开水中剥离其外边的滤泡膜后加入具有受精能力的精子,即能使成熟卵受精,受精膜举起,胚盘在动物极形成。其后受精卵的分裂、发育等与自然成熟受精卵相同。以发育至囊胚为受精标准,这种体外成熟卵受精率为78％。这是斑马鱼卵母细胞体外培养成熟的首例报道。鱼类卵母细胞体外成熟技术的建立,为外源基因卵母细胞胚泡内转移奠定了基础。     

猪卵母细胞体外成熟和体外受精卵表面元素的研究

本文应用X-射线能量色散技术对猪卵泡内卵母细胞,培养不同时间卵母细胞和体外受精卵进行了表面元素的定性和定量分析,结果表明,(1)在卵母细胞和受精卵的表面均含有Na、Mg、Al、Si、S、Cl、K、Ca和Fe元素;(2)A级卵母细胞随着体外培养,Ca的含量逐渐升高,而K的含量逐渐降低;(3)B、C级卵母细胞随着其培养Al、Ca~(2+)降低;(4)受精后卵表面的Ca显著升高。     

硬骨鱼类卵母细胞最终成熟机制的研究进展

在硬骨鱼类中,发育完全的未成熟的卵母细胞被阻滞在第一次减数分裂前期,这一时期也称为生发泡期。性成熟后,当卵母细胞受到促黄体生成素及其他内分泌、自分泌/旁分泌因子的调节,可突破第一次减数分裂阻滞,发生生发泡破裂,这标志着卵母细胞恢复了第一次减数分裂。这一过程被既复杂又严格精密的机制所调控,对产生可受精的雌配子尤为关键。明确卵母细胞成熟分裂进程中的调控因子及各因子之间直接或间接地相互作用是目前研究的热门领域,但是关于这些机制的研究主要集中于哺乳动物,在硬骨鱼类中的研究相对较少且分散。因此,本研究综述了近年来国内外硬骨鱼类卵母细胞最终成熟过程调控机制及研究进展;以第一次减数分裂的阻滞和第一次减数分裂的恢复两条主线,重点分析总结了17β-雌二醇、环磷酸腺苷、胰岛素样生长因子、丝裂原活化蛋白激酶等调控因子及它们与上游调节因子和下游作用底物构成的信号网络对此过程的调控。本综述为研究硬骨鱼类卵母细胞的最终成熟机制提供理论支持与参考。     

卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

探讨山羊卵母细胞体外成熟培养的影响因素,为优化山羊体外受精程序奠定基础。比较从屠宰场采摘的山羊卵巢运输温度和体外培养促成熟因子对卵母细胞体外成熟培养和体外受精效果的影响。结果表明,在运输温度接近室温(25±2)℃时的卵母细胞成熟率显著高于接近体温(36±2)℃时的运输温度(成熟率分别为53.8%,35.0%,P0.01),两种运输温度的卵巢卵母细胞成熟培养后体外受精率无显著差异(分别为37.9%,36.6%,P0.05)。与在体外成熟基础培养液(M1:M199 media+1μg/mL E2+10μg/mL FSH+10μg/mL LH+20%EGS)中进行成熟培养相比,在基础培养液中仅添加20 ng/mL EGF(M2)和另外添加10%GFF(M3)进行体外成熟培养的卵母细胞成熟率均有明显提高,其中成熟率在M1为53.8%,极显著低于M2的69.5%和M3的72.6%,P0.01;M2和M3间差异不显著;卵母细胞成熟培养后体外受精率在三者间无明显差异分别为37.9%,39.5%和40.6%,P0.05。山羊体外受精时从屠宰场采摘的卵巢宜在室温条件下进行运输,在体外成熟培养体系中加入EGF和GFF均可有效促进山羊卵母细胞的体外成熟,但EGF起关键作用。     

山羊卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨卵巢大小对卵母细胞体外成熟的影响。方法根据质量将卵巢分为3组,Ⅰ组质量小于0.95 g,Ⅱ组质量介于0.95~1.7 g,Ⅲ组质量大于1.7 g,并统计了不同组卵母细胞的体外成熟率、孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率,以及克隆胚的卵裂率和囊胚率。结果 3组卵母细胞体外成熟率分别为62.25%、43.58%和40.7%;3组孤雌激活胚卵裂率分别为83.77%、82.92%和79.73%;孤雌激活胚囊胚发育率分别为19.51%、18.9%和18.78%;3组克隆胚的卵裂率分别为67.36%、65.97%和66.33%;克隆胚囊胚发育率分别为11.63%、13.41%和12.29%。Ⅰ组卵母细胞体外成熟率显著高于其余2组,3组之间孤雌激活胚卵裂率、孤雌激活胚囊胚率、克隆胚卵裂率和克隆胚囊胚发育率差异无统计学意义。结论上述结果表明来源于小卵巢的卵母细胞体外成熟率最高。卵巢大小仅影响卵母细胞的体外成熟率,对发育能力无影响。     

小鼠体外发育成熟卵母细胞的胞浆成熟度评估

研究通过检测卵母细胞直径、谷胱甘肽含量和皮质颗粒分布来评估其胞浆成熟度。培养小鼠窦前卵泡13 d,得到258个体外发育MⅡ期卵母细胞;控制性超排得到205个体内发育的MⅡ期卵母细胞。测量卵母细胞直径,用免疫荧光染色、共聚焦显微镜观察卵母细胞皮质颗粒分布,化学法测定卵母细胞谷胱甘肽含量。结果发现,体外发育的卵母细胞直径(69.6±5.7)μm,体内发育卵母细胞直径(84.2±3.0)μm,两组间存在显著性差异(P<0.01)。体外发育成熟卵母细胞谷胱甘肽含量(4.3±0.7)pmol,体内发育的卵母细胞谷胱甘肽含量(6.1±1.0)pmol,两组间存在显著性差异(P<0.05)。体外发育卵母细胞皮质颗粒环状分布率36%,体内发育卵母细胞皮质颗粒环状分布率90%,两组间存在显著性差异(P<0.01)。本实验认为,体外发育成熟的卵母细胞胞浆成熟度与体内发育成熟的卵母细胞存在差异,可能是其发育潜能降低的原因之一。体外培养的卵泡内分泌结构改变可能影响卵母细胞胞浆成熟。     

小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精的效果观察

目的　研究不同培养条件对小鼠卵母细胞体外成熟及体外受精率的影响。方法　小鼠卵母细胞分别在含有FSH、BSA和胰岛素的培养液中体外成熟,在Whitten 氏液中体外受精,比较体外成熟率、体外受精率。结果　1- 裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率(81-4% ,31-0 % ) 均高于卵丘卵母细胞复合体(COC)(48-6 % ,27-1% ) 。2- 在培养液中添加FSH、胰岛素和BSA,卵母细胞的体外成熟率为77-9 % ,82-3% 、60-7% ;体外受精率为77-2 % 、72-6 % 、26-7% ;2 - 细胞率为49-2 % 、34-2 % 、10-0% 。胰岛素组的卵母细胞IVM 率最高,但IVF率、2 - 细胞率低于FSH 组。3- 添加BSA的两组的体外受精率只有26-7 % 、25-8 % ,显著低于其他组,其体外成熟率也较添加FSH 和胰岛素的组成。4- 排出第一极体(PbI) 的卵母细胞的体外受精率和2 - 细胞率(85-9 % ,22-4% ) 均高于GV期卵母细胞(71-1 % ,12-9 % ) 。结论　1- 卵丘卵母细胞(COC) 较裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率都低,差异显著(P成熟< 0-01;P受精< 0-05) 。2-FSH 和胰岛素均能提高小鼠卵母细胞的体外成熟率、体外受精率。3-BSA可以降低小鼠卵母细胞体外受精率,差异极显著。4-GV 期卵母细胞的体外受精率显著低于体外培养的排出第一极体的卵母细胞(P2 - cell < 0-05,P受精<0-05)     

牦牛体外成熟卵母细胞差异转录组学研究

卵母细胞体外成熟环节是现代繁殖育种技术的基础环节,体外成熟的MⅡ期卵母细胞的质量直接影响了卵母细胞的后续受精及受精卵卵裂.由于卵母细胞的发育成熟是一个涉及大量基因转录调控的复杂过程.因此,转录组学研究是了解卵母细胞发生发育的关键.本研究以高海拔地区的特有牛属动物牦牛(Bos grunniens)卵母细胞作为研究对象,应用RNA-seq技术对牦牛GV期卵母细胞及体外成熟MⅡ期卵母进行转录组学测序及比对分析.经深度测序后,各获得一个包含51380686条过滤测序序列(cleanreads),4624261740碱基(bp)的GV期牦牛卵母细胞测序文库和一个包含50303412条过滤测序序列(clean reads),4527307080碱基(bp)的MⅡ期牦牛卵母细胞测序文库.基因覆盖率统计表明,GV期和MⅡ期文库中分别有16719条和16339条牦牛基因得到转录.通过比较分析MⅡ和GV期转录组数据,共筛选出4767个差异表达基因,其中1418个基因表达量上调和3349个基因表达量下调.GO功能分类注释显示,差异基因与"代谢过程"等生物学过程存在密切关联,同时结合分子功能相关类别等分子事件表现活跃.按表达量上调和下调分别对差异基因进行KEGG通路互作分析,结果表明,凋亡通路、内吞通路及代谢通路是上调的关键调控通路,而代谢通路、丙酮酸代谢、黏着斑及氧化磷酸化是下调的关键调控通路,其中代谢通路在上调及下调通路互作中均起关键调控作用.进一步对代谢通路进行分析,结果表明,组氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢及谷胱甘肽代谢是整个代谢通路的关键调控节点。此外,本研究发现,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,与免疫相关的白细胞介素家族及干扰素家族基因发生了显著差异表达.该研究结果为进一步解析牦牛卵母细胞发育的分子机制及全面了解牦牛繁殖的特异性提供了基础.     

小鼠卵母细胞体外成熟不同阶段对钙的依赖性

本研究旨在探讨小鼠卵母细胞成熟与钙和钙调素的关系。研究发现,20μmol/L W7、50μM BAPTA/AM对GVBD发生没有影响,但阻断了中期Ⅰ的卵母细胞进入中期Ⅱ。通过测定成熟不同阶段细胞内钙的分布,发现GVBD后染色体周围区域有较高水平的钙分布,并且该现象能被加BAPTA/AM而消除。GVBD发生后6h左右高钙分布现象消失。我们还测定了成熟过程中MPF活性的变化,20μmol/L W7、50μmol/L BAPTA/AM对卵母细胞成熟过程中MPF活性的升高没有影响。结果表明:小鼠卵母细胞GVBD的发生不依赖钙和钙调素;钙和钙调素对中期Ⅰ的发育是必需的,并且核周区钙分布可能起着重要作用。     

小鼠卵母细胞体外成熟不同阶段对钙的依赖性

To determine the role of calcium and calmodulin in mouse oocyte maturation, we examined the distribution of intracellular calcium during mouse oocyte maturation by using Mira Cal Imaging System. The calcium was present homogeneously in oocytes with intact germinal vesicle (GV) and accumulated around the nuclear region after GV breakdown(GVBD). The high level of calcium disappeared 6 hours later after GVBD. In the presence of 50 mumol/L BAPTA/AM, we failed to observe this phenomena. All eggs treated with 20 mumol/L W7, an antagonist of calmodulin, 50 mumol/L BAPTA/AM, a calcium chelator, could not develop to metaphase II (MII), although GVBD was not affected. We also detected the activity of a cytoplasmic maturation-promoting factor (MPF). W7 and BAPTA/AM had no effects on the rise of MPF activity in the course of maturation. We suggest that compartment distribution of calcium around nuclear region plays an important role in mouse oocyte maturation.     

山羊卵母细胞体外成熟过程中线粒体的动态分布

目的研究山羊卵母细胞减数分裂过程中线粒体的动态分布。方法收集山羊卵母细胞,在M199中分别培养4、8、12、16、20和24 h,用特异性线粒体标记探针进行标记,用激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体的分布情况。结果生发泡期线粒体多分散在卵母细胞的胞质内,并且距生发泡有一定的距离;生发泡破裂期线粒体逐渐移向染色质;第一次减数分裂中期与第二次减数分裂中期线粒体成簇密布在染色体周围。排出的第一极体中也含有大量的线粒体。结论同其他哺乳动物卵母细胞体外成熟过程中线粒体分布情况相比,线粒体在山羊卵母细胞中的分布具有明显的相似性。线粒体密布在成熟卵母细胞染色体周围可能与极体的排出和受精后染色体的迁移有关。