猪气喘病实验猪模型的建立

目的 研究建立猪气喘病人工发病模型。方法 将分离得到的一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)Js株进行各种试验鉴定,证实其为Mhp强毒株。每头猪肺内接种Js株培养物2ml,15～25d后观察临床症状和病理变化,采集病变组织,经冻干制成攻毒用组织毒。安检合格,批号为20000324。给15头小梅山二元杂交猪分别气管内注射以KM₂培养基作10^-2、10^-3、10^-4和10^-5稀释的强毒,每头猪5ml,对照组注射培养基。攻毒后25d观察试验猪临诊症状,X线透视,记录病理变化。结果 10^-2、10^-3、10^-4稀释的强毒试验组猪均出现了典型的猪气喘病临床症状和病理变化。结论 人工发病试验测得Mhp Js株组织强毒接种气管内注射最小发病剂量为10^-4稀释5ml,正式试验人工发病可用100个最小发病剂量即强毒冻干物1:100稀释气管内注射5ml,可确保攻毒成功。     

代谢工程中基因修饰与基因表达的工具

代谢工程利用重组DNA技术导入定向改造的基因 ,以改进微生物细胞的某些代谢特性 ,已经发展成为一个工业微生物育种和优化发酵过程的强有力工具。基因的修饰与表达是代谢工程的重要组成部分。本文介绍了近年来代谢工程中基因修饰与表达所用的工具方面的进展。     

基因修饰大鼠模型的研究进展

相比小鼠,大鼠在生理水平和认知能力等方面与人类更加接近,而且体型更大更容易操作,因而是研究人类疾病的良好模型。然而,由于遗传修饰技术发展的滞后,基因修饰大鼠模型的应用远远落后于小鼠。近年来,随着大鼠胚胎干细胞和位点特异性核酸酶等技术的发展,大鼠的遗传修饰得了一系列重要的进展。对各种遗传修饰技术在大鼠中的应用进行综述,为制备基因修饰大鼠模型提供参考。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

小型猪慢性胰腺炎模型的建立

目的建立小型猪慢性胰腺炎（CP）模型。方法西双版纳小型猪28头,随机分两组,6头为正常对照．22头经剖腹行胰管不全结扎。术后2～12周处死取出胰腺,同时取出正常组胰腺行组织学检查,进行病理分期,观察分期与喂养周数间关系。结果胰管结扎的22头小猪存活18头,15头胰腺体尾部形成CP,成功率68．2％。CP严重程度随胰管结扎后喂养周数增加而增加（r=0．39,P〈0．05）。结论小型猪胰管部分结扎能形成CP．其严重程度与胰管结扎后喂养周数间呈部分相关关系。     

小型猪腹壁拉链模型的建立

目的建立小型猪腹壁拉链模型并对其生物学特性进行研究,为教学和科研工作的开展提供便利的研究工具。方法通过外科手术的方法将定制的生物拉链固定于小型猪体表,建立小型猪腹壁拉链模型,观察小型猪的体征和精神状态,利用全自动血液分析仪及尿液分析仪对其血液和尿液生化指标进行动态检测。结果模型建立后7-49d小型猪的活动、精神状态良好,其生理生化指标表现稳定,与对照相比无显著变化。结论本课题组建立的小型猪腹壁拉链模型建立后7-49d体征、精神状况良好,生理生化指标稳定,可以推广应用于相关的科研、教学试验。     

非人灵长类基因修饰模型研究进展

非人灵长类动物在生命科学基础研究和生物医药研究领域具有非常重要的地位。近年来随着慢病毒载体转染及靶向核酸酶(ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9)等基因操作技术的出现,科学家们成功地获得了外源基因过表达的转基因猴和目的基因定点切割的基因编辑猴。文中对目前利用慢病毒载体获得转基因猴和利用靶向核酸酶获得基因编辑猴的研究进展进行了综述,并讨论了基因修饰猴的嵌合体现象、脱靶现象及非人灵长类动物较长性成熟时间这几个影响非人灵长类基因修饰模型推广应用的因素,最后展望了非人灵长类基因修饰模型构建技术的研究热点及发展趋势。     

猪呼吸道上皮细胞体外分化模型的建立及其应用研究

猪是许多呼吸道病毒感染的天然宿主,其与人类在肺生理学、呼吸道形态学和呼吸道细胞类型以及受体分布都有相似之处。为了解呼吸道病毒感染机制和筛选呼吸系统疾病药物,选择以猪肺组织为原料采用无血清气液界面培养法构建一种猪呼吸道上皮细胞(Porcine airway epithelial cell,PAEC)体外分化模型,然后通过扫描电子显微镜、电生理和免疫组织化学等方法鉴定该模型。采用三质粒共转染法构建重组腺相关病毒rAAV6-GFP(rAAV6-green fluorescent protein,rAAV6-GFP),通过顶端表面感染PAEC模型,探讨AAV6在PAEC模型中基因治疗领域的应用。结果显示分化成熟的PAEC模型为多层上皮结构,顶端表面含有纤毛细胞、黏液分泌细胞和基底细胞。rAAV6-GFP能通过顶端表面感染PAEC,有效地介导外源基因的长期表达。本文建立的猪呼吸道上皮细胞体外分化模型为呼吸道病原体感染和呼吸系统疾病药物筛选和基因疗法等研究奠定了良好的基础。     

基因修饰猪作为异种器官移植供体的研究进展

器官移植是治疗脏器器官终末病变的根本方法,目前器官移植的最大障碍是供体器官的缺乏。异种器官移植为解决上述难题打开了一扇门。猪与人类在解剖学和生理学等方面非常相似,是理想的器官移植的供体。基因修饰猪在异种器官移植中有着重要的应用,该文就猪–人异种器官移植发生免疫排斥的机制及其对策、器官移植后的生理功能以及潜在的病毒感染风险等方面的研究进行了综述和讨论,为异种器官移植提供理论基础。     

人脑胶质瘤小型猪原位移植模型的建立及评估

目的利用免疫抑制剂处理小型猪,建立人脑胶质瘤小型猪原位移植模型,为胶质瘤药物筛选和影像学研究提供与人体相近的实验工具。方法人胶质瘤细胞U87-MG移植于裸鼠皮下,待形成肉眼可见肿瘤后备用。选择小型猪联合口服免疫抑制剂环孢素软胶囊(20 mg/kg)和他克莫司胶囊(0.01 mg/kg)进行免疫干预。3 d后,取裸鼠皮下新鲜的U87-MG肿瘤组织,将其修剪为1 mm3组织块,通过立体定向仪和套管针将肿瘤组织移植于经免疫抑制剂处理的小型猪大脑纹状体,持续使用免疫抑制剂21 d,进行核磁共振成像,确认肿瘤的位置。必要时处死动物并解剖,取肿瘤组织固定,进行HE和IHC染色以确定肿瘤的组织形态。结果 12头猪进行了原位移植,3周后,核磁检测确认11头猪成像,肿瘤发生率达到90%以上,胶质瘤猪原位移植模型肿瘤组织HE染色结果、生长特征均符合肿瘤特征;人线粒体抗体染色显示其为人源性组织,胶质瘤特异性标志物GFAP表达阳性。结论联合环孢素软胶囊和他克莫司免疫抑制处理,通过移植肿瘤组织成功建立人脑胶质瘤小型猪原位移植模型。     

猪轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为了建立一种适用于猪轮状病毒(PoRV)的逆转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)的快速、灵敏检测方法。依据GenBank上登录的PoRV VP7基因保守序列,设计了6条特异性引物,通过对外引物与内引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和反应条件等进行优化。结果显示,当外引物与内引物浓度比为200nmol/L∶2 400nmol/L(1∶12)、Bst DNA聚合酶浓度为0.64 U/μL、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、dNTP浓度为1.0mmol/L,在恒温(60℃)条件下作用60min,扩增效果出现明显"梯状"条带,同时对建立的RT-LAMP检测方法进行特异性和敏感性验证,其只有PoRV获得特异性扩增条带,与其他猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒等无交叉反应,具有良好的特异性,最低检测分子拷贝数为1.0×102拷贝/μL,具有极高的敏感性。反应结束后肉眼可见阳性扩增产物出现白色沉淀,加入SYBR GreenⅠ观察颜色变化可以判定结果。该方法适用于野外、基层部门和海关快速检测PoRV的新方法,在临床上有良好的推广意义。     

油酸诱导小型猪肺水肿模型的建立

目的制备油酸诱导小型猪肺水肿的动物模型,便于进行肺水肿的发病机制和相关治疗的研究。方法家养小型猪20只麻醉后随机分A、B两组,A组（n=10）为对照组,B组（n=10）为油酸组（油酸0.15 mL/kg经动物耳缘静脉缓慢注射）,观察两组动物肺组织病理改变、计算肺含水量及肺湿干重比。结果B组动物注射油酸后肺部出现明显的肺水肿病理改变,肺湿/干重比及肺含水量的值明显高于A组（P〈0.05）。结论本实验成功复制油酸诱导小型猪肺水肿动物模型,其病理组织切片符合肺水肿的典型病变。     

小型猪涩脉模型的建立与评价

目的基于小型猪的生理特点及循环系统与人类极为相似的特征，通过药物对其造模，建立一种新型的脉诊动物教学模型并对其进行评价。方法选用中华实验用成年小型猪6只（体重20±1．6kg，选取心率〈100次/min）。采用戊巴比妥钠麻醉，定位取脉位置，切脉后，用NX-8型脉诊仪同步采取正常脉图、二导心电图，血流动力学参数，血流变学指标。耳大静脉心得安注射液及葡聚糖T-500静脉给药进行造模，观察造模后一般情况（心率、皮肤颜色）及指下脉形变化，同步描记脉图及二导心电图，涩变后记录数值：不同时间点的心率变化；主波高（HB）、升支斜率（Sup）、降支斜率（Sdown）、降中峡位置（即降中峡高，主波高HE/HB）、升支时间，脉波周期（TAB/TAG）、主波峰时间，脉波周期（TB/TAG）；并采集造模后血流动力学及血流变学各项参数。结果6头小型猪均造模成功，指下感觉涩变明显；脉图变化显著；与造模前相比HB、Sup、Sdown、HE/HB、TAB/TAG、TB/TAG差异均有显著性（除SdownP〈0．05外，其余均P〈0．01）。血流动力学及血流变学相关参数差异也均有显著。讨论通过运用小型猪建立涩脉模型成功、方法可靠，小型猪应用于脉诊教学实验方法简便、损伤小、可重复运用，有充分的可行性，以此为基础可以建立多种脉诊模型，以补充脉诊实验教学中的空白。     

小型猪急性心肌梗死模型的建立及其评价

目的探索结扎小型猪冠状动脉左前降支（LAD）建立急性心肌梗死模型及进行血流评价的方法。方法小型猪20头全麻下开胸暴露心脏,预阻断LAD（第二对角支）15min,后予结扎,术中心电图动态监测,术后进行冠状动脉造影,心肌酶学监测以确定模型建立情况,冠状动脉造影以及^13N-NH3 PET心肌血流测定评价手术后血流改变。结果20头小型猪中有16头存活4周,成活率80％,开胸手术中1头因麻醉意外死亡,3头死于术后呼吸不畅。结扎后心电图呈动态变化,24h后血清心肌酶谱（CK,CK—MB,cTnI）较术前明显增高,差异有统计学意义（P〈0．05）,冠状动脉造影显示LAD血流中断,TIMI分级为0级,^13N—NH3 PET检查显示手术后缺损面积百分比（27．0±5．0）较手术前（4．0±3．2）有显著性差异,证实心梗模型建立成功。结论本实验中开胸手术成功率高,术后血流评价方法可用于手术前后冠脉血流和心肌血流的比较以及对心肌梗死后治疗效果进行评价。     

非人灵长类基因修饰模型构建技术研究进展

随着以CRISPR-Cas9为代表的新型基因编辑技术的出现及发展应用,科学家们在构建非人灵长类基因修饰模型方面取得了很多重要进展。然而,首建动物嵌合、复杂基因修饰低效、传代周期长以及遗传背景复杂等多方面因素极大地限制了非人灵长类基因修饰模型的开发和应用。现对目前非人灵长类基因编辑模型构建的进展进行综述,并重点对基因编辑技术结合体细胞核移植、精原干细胞、胚胎干细胞及单倍体干细胞等技术手段在非人灵长类基因修饰模型构建中的进展进行综述和展望。     

生长猪蛋白质周转代谢三室模型建立及参数求解

介绍了用房室分析方法研究蛋白质动态代谢规律的数学模型,建立了蛋白质动态代谢的三室模型并给出了用单剂量终末产物法求解改模型参数的具体方法。     

跳动心肌细胞微型培养模型的建立及应用

自Harary最初报告了培养的心肌细胞能够继续跳动以来,跳动心肌细胞培养模型已被广泛应用于心肌功能、代谢及结构的研究,并取得了不少成绩。跳动心肌细胞培养还可用于检测血清或其制品中是否存在影响心肌收缩、代谢或具有心肌毒性物质。我国中医研究院西苑医院基础研究室应用此模型进行中药     

猪同种异体原位左肺移植模型的建立

目的建立接近于人的猪同种异体左肺原位移植动物模型。方法环江香猪12只作为供体,巴马香猪12只作为受体,左侧第4肋间开胸,完成左肺原位移植。术后1、2、4、6、12 h开胸测左、右肺动脉的压力,同时取左、右肺静脉血进行血气分析,取左、右肺组织,观察含水量及病理学改变。结果动物术后均存活,随着术后时间延长,供肺静脉血氧合指数(Pa O2/Fi O2)下降和肺动脉压(PAP)上升,与受体正常肺比较,差异有显著性(P0.05)。随着时间的推移,移植肺组织出现水肿、炎性细胞浸润、红细胞渗出,肺泡壁增厚明显,部分肺泡腔完全闭塞,部分肺组织实变等变化,与受体肺组织比较,含水量增加显著(P0.05)。结论为研究肺移植缺血再灌注损伤及免疫排斥反应研究机制提供了理想的动物模型。     

猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

目的　建立猪内源性反转录病毒感染HEK2 93细胞的模型 ,验证PERV在体外对人源细胞的感染性 ,并进一步研究PERV的生物学特性。方法　将G4 18抗性的HEK2 93细胞与猪源PK 15细胞共培养 ,6周后 ,用含有6 0 0 μg mlG4 18的选择性培养基对共培养细胞进行加压筛选 ,用以除去共培养体系中的PK 15细胞 ;然后应用PCR及RT PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果　经 6周共培养及 3周加压筛选后 ,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化 ;PCR及RT PCR鉴定表明 ,筛选后的共培养体系中已没有PK 15细胞的存在 ;PERV特异性检测方法检测显示 ,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。结论　本实验成功建立了PERV感染HEK2 93细胞的模型 ,证实了PERV在体外对人源细胞具有感染性 ;为PERV生物学特性的研究奠定了基础     

经胸腔镜建立巴马小型猪冠状动脉狭窄模型

目的探讨一种高效、稳定的经胸腔镜构建不同程度冠状动脉狭窄动物模型的方法。方法 20头巴马小型猪,在胸腔镜直视下手术丝线永久性环扎左前降支近端,从而造成前降支不同程度的狭窄。术后进行定量冠状动脉造影检查评价狭窄程度。结果 20头小型猪中18头手术顺利完成,2头术中出现室颤,除颤成功后分别于术后8 h和48 h死亡。术后行定量冠状动脉造影显示7头小型猪狭窄程度不超过50%,6头狭窄程度在50%到70%,5头狭窄程度在70%以上,即时手术成功率100%,建模成功率90%。结论完全胸腔镜下应用丝线环扎法可成功地制作不同程度的冠脉狭窄动物模型。