毕赤酵母X-33OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF

【目的】酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰,产生高甘露糖型糖链,影响蛋白的活性,其中α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统。【方法】采用双交换同源重组敲除目的基因的方法,首先敲除毕赤酵母X-33的URA3基因,获得一个尿嘧啶营养缺陷型的X-33(ura3-)菌株;然后用URA3基因作为选择标记,敲除X-33(ura3-)的α-1,6甘露糖转移酶(och1p)基因,获得OCH1基因敲除的X-33(och1-)菌株。用X-33(och1-)菌表达糖蛋白GM-CSF,分析GM-CSF蛋白糖链的变化。【结果】首次成功敲除了X-33的URA3和OCH1基因,与野生型相比,X-33(och1-)菌表达的GM-CSF蛋白过度糖基化修饰程度明显降低。【结论】X-33(och1-)菌株的构建提供了一个对蛋白低N-糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,也为进一步的糖基化改造提供了良好的基础。     

α-1,6-甘露糖转移酶基因敲除的毕赤酵母菌株构建及其用于融合蛋白HSA/GM-CSF 表达的研究

酵母对蛋白的糖基化修饰过程不同于哺乳动物,其特点为产生高甘露糖型糖基且易发生过度糖基化。本研究通过两步基因重组敲除目标基因的方法成功敲除了毕赤酵母中的α-1,6-甘露糖转移酶(och1p)基因,获得了och1敲除的菌株。以此为基础,构建了高效表达人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白(HSA/GM-CSF)的工程酵母,与野生型毕赤酵母表达的过度糖基化HSA/GM-CSF不同,och1敲除菌表达的该融合蛋白糖基化程度明显降低,这为该融合蛋白的开发提供了重要基础。och1敲除菌株的构建不仅提供了一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统,而且为进一步的酵母糖基工程改造提供了基础。     

一种两步基因同源重组敲除酵母靶标蛋白基因的方法

目的:建立一种在代谢工程改造的毕赤酵母菌中高效敲除靶标蛋白基因的方法。方法:构建敲除载体,以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因为靶基因,以尿嘧啶合成关键酶URA3基因为营养缺陷型筛选标记,第一步重组利用ura3正筛选获得敲除载体在酵母染色体中的定点整合,第二步通过5-氟乳清酸(5-FOA)筛选到表型为ura3-的克隆,ura3基因被剔除的同时,目的基因GM-CSF也随之丢失,实现第二次重组;利用基因组PCR和蛋白电泳进行鉴定。结果:通过两步基因同源重组,敲除了毕赤酵母GJK01的报告蛋白GM-CSF的编码基因388 bp,PCR结果显示该基因已完全丢失,SDS-PAGE分析无GM-CSF表达。结论:仅通过2周时间的筛选、鉴定,在毕赤酵母GJK01中敲除了报告蛋白GM-CSF的编码基因,突变菌株的阳性率达到50%,最终建立了以URA3为筛选标记的两步基因同源重组敲除目的基因的方法。     

重组人粒细-巨噬细胞集落刺激因子在毕赤酵母中的表达及活性分析

目的:利用毕赤酵母野生型菌株GS115(his4)和突变型菌株GJK01(ura3,adel,arg4,his4,ochl)表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF),并对其活性及糖基修饰情况进行比较.方法:用PCR技术扩增目的基因,引入Xho I、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析.结果:hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79x105和2.21x10s U/mL.结论:利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型.     

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的克隆及在毕赤酵母中的表达

采用加长引物5＇端的方法克隆了hGM-CSF的编码基因,克隆过程中对该基因的局部做了密码子优化。然后克隆进毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电击转化毕赤酵母。PCR、SDS-PAGE与Western blotting证实hGM-CSF已整合进酵母基因组,摇瓶水平粗蛋白表达量达389mg/L,动物实验证实蛋白产物活性正常,SDS-PAGE与N-糖苷酶F去糖基化分析发现hGM-CSF被糖基化。     

N-糖基化位点突变的人IFN-λ1在毕赤酵母中的表达、纯化及表征

IFN-λ1是Ⅲ型干扰素家族的一个成员,具有与Ⅰ型干扰素相似的功能。此前,我们已经从毕赤酵母表达获得了可溶性重组人干扰素-λ1。然而,毕赤酵母表达中的高糖基化带来了免疫原性,影响了蛋白质的生产纯化效率。为了克服这个缺点,文中构建了一种干扰素突变体 (rhIFN-λ1-Nm),定点突变潜在糖基化位点。AOX1启动子与α因子信号序列存在的情况下,用甲醇诱导成功地实现了rhIFN-λ1-Nm在毕赤酵母GS115胞外分泌表达。对rhIFN-λ1-Nm进行纯化,获得了纯度>98%的产品,并对糖化水平、分子量、二级结构、N末端序列等理化性质和生物活性进行了研究。研究结果表明,rhIFN-λ1-Nm糖基化水平明显降低,蛋白质生产纯化收率显著提高,而对结构和生物活性无影响;糖基化位点突变rhIFN-λ1可以被开发为IFN-λ1的替代品,有望发展成为未来的生物免疫制剂。     

猪GM-CSF基因的克隆及其真核表达载体的构建

采用PCR方法从猪外周血液淋巴细胞cDNA中扩增出与预期设计大小相符的GM-CSF基因特异性条带,PCR产物经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,插入到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GM-CSF.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性.将构建好的真核表达质粒转染到山羊胎儿成纤维细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功.pIRES2-EGFP-pGM-CSF真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GM-CSF蛋白功能以及进一步将其开发为高档疫苗佐方剂奠定了基础.     

N-糖基化对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和活性的影响(英文)

溶栓剂DSPAα1正处于治疗急性缺血性中风的III期临床研究,临床结果显示DSPAα1具有良好的药理学和安全特性。将DSPAα1基因序列按照毕赤酵母偏好密码子进行优化,并在毕赤酵母菌株GS115和KM71中进行表达,同时利用定点突变对糖基化侧链进行缺失,考察糖基侧链对毕赤酵母表达DSPAα1的影响。结果表明,野生型DSPAα1在GS115和KM71中均获得高表达,在摇瓶发酵条件下,表达量分别为70mg/L和105mg/L;利用SDS-PAGE对DSPAα1三种突变体(N117Q、N362Q和N117Q/N362Q)进行分析,与野生型蛋白质相比较,3种突变体的表达水平显著下降,同时纤溶平板测活数据显示,纯化后的突变体N117Q和N362Q比活性均低于野生型蛋白质的25%。这表明,N-型糖链(N117和N362)对毕赤酵母表达的DSPAα1分泌和酶活性具有重要作用。     

猪生长激素基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及产物的N-糖基化分析

利用含有强启动子P_AOX1 和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA构建出含PST基因的重组质粒pPICZαA pST。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST质粒转化到巴斯德毕赤酵母X 33菌中 ,并筛选Mut+ 表型的重组菌。表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,分泌于胞外的PST蛋白分子量比天然PST分子量稍大 ,而胞内的PST蛋白分子量与天然PST大小相同。将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA pST再次转化重组酵母细胞X 33 pPICZαA pST(Mut⁺) ,所得表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果显示 ,PST基因的表达水平明显提高 ,且表达产生的蛋白均可发生正确的抗原 抗体结合反应 ,表达量达 95 6mg L。将发酵液上清进行N 糖基化分析 ,显示rPST无N 糖基化加工修饰     

毕赤酵母不对称合成阿托伐他汀中间体

阿托伐他汀可通过抑制HMG-CoA还原酶与底物的结合来抑制胆固醇的合成,而 (R)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯是阿托伐他汀合成的重要中间体。通过对实验室保藏菌种进行筛选,得到一株巴氏毕赤酵母X-33可将5-邻苯二甲酰亚胺-3-氧代戊酸乙酯还原为 (R)-3-羟基-5-邻苯二甲酰亚胺基戊酸乙酯。在磷酸盐缓冲液体系中考察了初始底物浓度、反应时间、辅助底物、葡萄糖添加量、pH、温度等因素对产物收率和对映体选择性的影响,获得了较佳的反应条件。选择底物投料量为7 g/L时,当菌体浓度120 g/L,葡萄     

Scale-up of a high cell density continuous culture with Pichia pastoris X-33 for the constitutive expression of rh-chitinase

The feasibility of large-scale production of recombinant human chitinase using a constitutive Pichia pastoris expression system was demonstrated in a 21-L continuous stirred tank reactor. A steady-state recombinant protein concentration of 250 mg/L in the supernatant was sustained for 1 month at a dilution rate of 0.042 h(-1) (equivalent to one volume exchange per day), enabling a volumetric productivity of 144 mg/L d (240 U/L d). The steady-state dry cell weight concentration in this high cell density culture reached 110 g/L. Considering safety and economical aspects, all large-scale cultivations were conducted without molecular oxygen supplementation. Conventional air sparging was used instead. The oxygen demand of the process was determined by off-gas analysis (OUR = 4.8 g O(2) L(-1) h(-1) with k(L)a = 846 h(-1)) and evaluated with regard to further reactor scale-up.     

Molecular optimization of rabies virus glycoprotein expression in Pichia pastoris

In this work, different approaches were investigated to enhance the expression rabies virus glycoprotein (RABV‐G) in the yeast Pichia pastoris; this membrane protein is responsible for the synthesis of rabies neutralizing antibodies. First, the impact of synonymous codon usage bias was examined and an optimized RABV‐G gene was synthesized. Nevertheless, data showed that the secretion of the optimized RABV‐G gene was not tremendously increased as compared with the non‐optimized one. In addition, similar levels of RABV‐G were obtained when α‐factor mating factor from Saccharomyces cerevisiae or the acid phosphatase PHO1 was used as a secretion signal. Therefore, sequence optimization and secretion signal were not the major bottlenecks for high‐level expression of RABV‐G in P. pastoris. Unfolded protein response (UPR) was induced in clones containing high copy number of RABV‐G expression cassette indicating that folding was the limiting step for RABV‐G secretion. To circumvent this limitation, co‐overexpression of five factors involved in oxidative protein folding was investigated. Among these factors only PDI1, ERO1 and GPX1 proved their benefit to enhance the expression. The highest expression level of RABV‐G reached 1230 ng ml^?1. Competitive neutralizing assay confirmed that the recombinant protein was produced in the correct conformational form in this host.     

玉米大斑病菌STK1与EGFP融合基因载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

STK1基因是玉米大斑病菌调控分生孢子发育、渗透胁迫调节和致病性的重要MAPK基因。本文首先构建了含有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的毕赤酵母GSS115(Pichia pastoris GS115)表达载体p PIC3.5K-EGFP,再以玉米大班病菌模式菌株01-23的菌丝c DNA为模板,PCR扩增STK1基因,克隆到p PIC3.5K-EGFP,构建了STK1-EGFP融合基因的GS115表达载体p PIC3.5K-STK1-EGFP。利用电击转化法将该融合基因表达载体转化到GS115感受态细胞内,利用MD培养基筛选、PCR鉴定,获得了STK1-EGFP融合基因的毕赤酵母转化子。通过RT-PCR和荧光观察,发现STK1基因和EGFP基因均可以高效稳定地表达。另外,在试验中我们还发现,在STK1基因起始密码子前加入Kozak序列可以使STK1-EGFP融合基因的表达强度增强4.8倍。以上研究结果为STK1基因表达蛋白的亚细胞功能定位和抗体制备奠定了基础。     

蚓激酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增含自身信号肽的蚓激酶基因F238,将其克隆到pUCm-T载体上,并进行测序。GenBank登录号为:DQ202401。测序结果表明基因全长为738bp,共编码245个氨基酸,包括7个氨基酸的信号肽序列和238个氨基酸的成熟肽序列。与粉正蚓(Lumbricus rubellus)F-III-2相比,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99%,仅存在2个碱基的差异,导致2个氨基酸的突变。通过生物信息学方法对蛋白质的理化及结构特性进行分析预测,F238的等电点为4.61,含有11个半胱氨酸,形成3个二硫键。蛋白质分子主要由β折叠组成,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类。以重组质粒pUCm-T-F238为模板,通过PCR方法扩增去信号肽的蚓激酶基因F238-m,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9-F238-m,将其线性化后用电穿孔法导入酵母宿主菌GS115中。在MM和MD平板上筛选表型,经甲醇诱导后,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为28kDa左右,纤维平板法测定活力最高可达100U/mL。     

Modification of a gene encoding hybrid xylanase and its expression in Pichia pastoris

To obtain the protein expression of a hybrid xylanase in yeast, the gene encoding it was modified according to the codon bias of Pichia pastoris and expressed extracellularly in this yeast as an active xylanase, MBtx, exhibited a molecular mass of approximately 35 kDa on SDS–PAGE. The pH behavior of MBtx in terms of both activity and stability was similar to that of Btx, original gene product in Escherichia coli, while a certain difference was observed in optimal temperature for activity and in thermal stability. HPLC analysis revealed the xylan in wheat could be hydrolyzed by MBtx and the major hydrolysis product was xylotriose. These results showed codon usage played a key role in regulating the expression of the hybrid xylanase in P. pastoris and the recombinant hybrid xylanase, MBtx, produced by P. pastoris could be potentially useful in feed industry.     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

Pichia pastoris X-33 ΔGT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达

巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母,作为应用最广泛的真核表达系统之一,在以甲醇为唯一碳源时可以利用醇氧化酶启动子PAOX1进行外源蛋白的表达,但是这一过程会被甘油阻遏。近几年有研究表明,甘油转运体不仅有运输甘油的功能,还与甘油、甲醇的代谢有一定的联系。目的:构建了甘油转运体GT2(PAS_chr3_1076)缺失菌株P.pastoris X-33ΔGT2,研究该菌株的甘油去阻遏效应和在不同碳源培养基中诱导PAOX1启动子驱动外源蛋白的表达水平。方法:构建以甲醇诱导型启动子PAOX1调控外源基因EGFP的表达载体PAOX1-EGFP,经酶线性化后电转野生型菌株P.pastoris X-33获得重组菌株x-EGFP;通过同源重组的方法敲除GT2基因,获得ΔGT2-EGFP敲除菌株;以ΔGT2-EGFP和X-EGFP为出发菌株,在甘油、甲醇,以及甘油甲醇混合为碳源诱导醇氧化酶AOX1及绿色荧光蛋白EGFP的表达和生长情况,并检测在以甘油为唯一碳源时,胞外的甘油含量。结果:在以甘油甲醇混合碳源培养时,突变体ΔGT2-EGFP菌株中AOX1单位酶活比野生型菌株高出近35%,单位荧光强度要高出近70%;在以甘油为唯一碳源时,X-EGFP最终收获时的生物量比ΔGT2-EGFP多,且发酵液中甘油含量相对较少;以混合碳源培养时ΔGT2总外源蛋白表达水平最高。结论:实验表明,GT2参与甘油的吸收与代谢,ΔGT2突变株可在一定程度上解除甘油对甲醇的代谢抑制,暗示甘油转运体与PAOX1相关,且基于此研究结果有望优化出更高效的酵母表达系统。