K253R和N184V点突变对葡萄糖异构酶热稳定性的影响

用人工合成的寡核苷酸突变引物,以双引物法于重组Ｍ１３ｍｐ１９载体上进行定点突变,分别得到了葡萄糖异构酶的突变体ＧＩＫ２５３Ｒ和ＧＩＮ１８４Ｖ。测定它们的热稳定性,并将之与野生型酶比较,结果表明：（１）ＧＩＫ２５３Ｒ于７０℃、８０℃下的热稳定性小于野生型,但在７０℃、１ｍｏｌ／ＬＬ－鼠李糖中,两者的失活速度相近。另外;ＧＩＫ２５３Ｒ的比活是野生型的１．５倍。（２）ＧＩＮ１８４Ｖ的比活和热稳定性都远低于野生型,Ａｓｎ１８４为酶活性中心构象的维持所必需．本文还根据动力学数据和分子结构模型对以上结果作了初步分析．     

用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度

用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体（Ｎ１８４Ｄ和Ａ１９８Ｃ）。含突变体的重组质粒ｐＴＫＤ－ＧＩ１（Ｎ１８４Ｄ）和ｐＴＫＤ－ＧＩ２（Ａ１９８ｃ）在Ｅ．ｃｏｌｉＫ３８菌株中表达,用ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ和Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－３００ＨＲ柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明：（１）突变酶Ｎ１８４Ｄ的最适ｐＨ值下降了１个单位;等电点下降了０．６个单位     

Q20L及G247D定点突变对葡萄糖异构酶酶活和最适pH的改善

用双引物法对GI基因进行体外定点突变,构建了突变体Q20L和G247D。含突变基因的重组表达质粒pTKD-GIQ20L及pTKDGIG247D在E.coli K38菌株中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比：(1) GIQ20L的最适反应温度下降5℃,热稳定性为野生型酶的78%,对底物的亲和性增强;(2) GIG247D的酶活提高约33%,最适pH下降0.6个单位,但热稳定性降低。初步分析认为,Gln 20位于α0～α1螺旋之间,其亲水侧链被Leu的疏水侧链取代后,分子表面增强的疏水作用,反而不利于蛋白质的稳定,使GIQ20L的热稳定性降低。Gly247是酶活性中心β折叠(242～247aa)的最后一个残基。引入电负性极强的Asp后,可能改变分子的静电场分布,影响了活性部位的电荷传递过程,使GIG247D酶活提高。引入的电荷,可能改变活性中心可解离基团的pKa,使其最适pH下降。另外Asp247的侧链在周围空间结构中显得过于拥挤,易与其他侧链产生排斥,由此影响到β-折叠的稳定性,接近亚基结合面的Asp247,可能进一步影响到亚基间相互作用的稳定性,最终导致酶热稳定性的降低。GI酶活和最适pH的改善更利于工业生产。     

葡萄糖异构酶的生物工程研究进展

D-葡萄糖异构酶(GI)能分别催化D-葡萄糖和D-木糖异构为D-果糖和D-木酮糖. 它是工业上生产高果糖浆的关键酶. 在GI负氢离子转移机制中,其主要特征是底物的开环、通过C₂至C₁间负氢离子转移的GI异构化作用、以及产物的闭环. GI基因已在同源、异源宿主中获得克隆、测序和超量表达. 经过蛋白质工程改造的GI将是未来最重要的工业用酶之一.     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET-30b（＋）,以重组表达载体pET30b-FphyA^e为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^m（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-FphyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶pp-NP^e与野生型酶PP-NP^m-8相比：PP-NPA^e的最适反应温度上升了3气,75℃处理10min,热稳定性提高21％,比活力略有提高。最适反应pH为5．6,有效pH范围pH4,6到pH6．6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3．5K—lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PELD92P—GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U／mL,约为野生型的29％。结果分析表明,Pro替代Asp^92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。     

单点突变葡萄糖异构酶(GIG138P)基因在变铅青链霉菌中的高效表达及其稳定性研究

通过三步亚克隆 ,将单点突变葡萄糖异构酶 ( GIG1 38P)基因及其调控序列插入链霉菌质粒p IJ40 83,构建重组表达质粒 p IJ40 83- GI1 .用重组质粒转化变铅青链霉菌 TK54原生质体 ,经硫链丝菌素抗性 ( Th R)筛选 ,获得重组菌株 TK54/p IJ40 83- GI1 .酶活力测定和 SDS- PAGE分析表明 ,GIG1 38P基因在变铅青链霉菌中得到高效表达 ,GI1粗酶液比活力为 1 5U/mg,GI1表达量约占菌体可溶性蛋白的 2 5% .同时也研究了重组质粒的遗传稳定性 .重组菌株在无选择压力条件下经液体连续传代培养 ,GI1比活力和 GI1表达量在 2 0 0 h传代时间中呈平缓下降趋势     

短乳杆菌葡萄糖异构酶固定化的研究

采用离子交换树脂ＤＥＡＥ纤维素对短乳杆菌葡萄糖异构酶进行固定化,并用固定化细胞使葡萄糖异构化为果糖,研究了制备固定化细胞最佳条件,而且与戊二醛交联法,海藻酸钙包埋法作了比较。还研究了固定化细胞的性质及连续转化的最佳条件,用ＤＥＡＥ纤维素固定化具有酶活力高,回收率高,机械强度好,成本低等优点。     

葡萄糖异构酶突变体酶GIGl38P和GIG138P-G247D在变铅青链霉菌中的高效表达及检测

将含有G138P单点突变和G138P－G247D双点突变的GI结构基因,分别克隆入E.coli-链霉菌穿梭载体pHZ-1272,成功构建了穿梭表达载体pHZGI1和pHZGI2。通过原生质体的转化,将穿梭表达载体异入变铅青链霉菌TK54菌株。30℃振荡培养24h,加入2μg/mL硫链丝菌素诱导表达12h。SDS－PAGE电泳表明,两个穿梭载体在TK54菌株内表达出42．5kD特异性条带。薄层扫描显示,突变体酶GIG138P和GIG138P－G247D分别约占可溶性蛋白的19％和22％。Western杂交进一步证实GIG138P和GIG138P－G247D在变铅青链霉菌TK54中获得了表达。     

Dimerization of Proline Dehydrogenase from Thermus thermophilus Is Crucial for Its Thermostability

Thermus thermophilus proline dehydrogenase ( TtProDH) catalyzes the first step in proline catabolism. The thermostable flavoenzyme consists of a distorted triosephosphate isomerase (TIM) barrel and three N‐terminal helices: αA, αB, and αC. Using maltose‐binding protein (MBP) fused constructs, it has been recently demonstrated that helix αC is crucial for TtProDH catalysis and for tetramerization through positioning of helix α8. Here, the structural features that determine the thermostability of TtProDH are reported. Selective disruption of two ion pairs in the dimerization interface of several MBP‐TtProDH variants result in the formation of monomers. The newly created monomers have improved catalytic properties but their melting temperatures are decreased by more than 20 °C. Sequence comparison suggests that one of the ion‐pairs involved in dimerization is unique for ProDHs from Thermus species. In summary, intermolecular ion‐pairs improve the thermostability of TtProDH and a trade‐off is made between thermostability and catalytic activity.     

Enhanced fructose levels in field grown potato tubers expressing a thermostable glucose isomerase

A thermostable glucose isomerase was expressed in Solanum tuberosum Desirée using the tuber-specific granular-bound starch synthase promoter. The fructose content was substantially increased in microtubers, greenhouse grown tubers as well as tubers produced in field trials as compared with the controls. Furthermore, the tuber yield of field grown potatoes was enhanced by 30% in the transgenic lines (from 1.04 kg/plant in the wild type to 1.36 kg/plant in the transgenic lines).     

编码序列的（G＋C）%与蛋白质的耐热性相关性分析

运用计算机统计方法,对以木糖异构酶为主的几个蛋白质家族的核酸和氨基酸序列进行分析,发现密码子各位上的（Ｇ＋Ｃ）％与编码序列的（Ｇ＋Ｃ）％成线性正相关,大多数氨基酸的含量与编码序列的（Ｇ＋Ｃ）％也存在相关性,按其相关性,将氨基酸分为正相关,负相关和不相关３类,对木糖异构酶氨基酸序列和酶的耐热性的统计发现,那些在统计学上显著的,可能提高蛋白质耐热性的氨基酸替换,往往伴随关编码序列中ＧＣ含量的上升,这提     

GI双突变体GIK253RA198C的构建及其性质分析

以双引物法对葡萄糖异构酶（GI）基因进行定点突变,将突变体基因于大肠杆菌中表达,获得了GI双点突变体GIK253RA198C.研究K253R和A198C双点突变对GI的结构和性质的作用,结果表明GIK253RA198C的热稳定性明显下降,最适反应温度降低5℃.文章从结构和机制上解释了为何同是K253R突变,对SM33 GI和密苏里游动放线菌GI的热稳定性产生不同的影响,认为这是由于Lys253在两种GI结构的位置上存在微小差异,从而使引入的Arg对亚基间的相互作用产生了相反效应所引起.     

Thermostability gradient in the collagen triple helix reveals its multi-domain structure

A triple-helical conformation and stability at physiological temperature are critical for the mechanical and biological functions of the fibril-forming collagens. Here, we characterized the role of consecutive domains of collagen II in stabilizing the triple helix. Analysis of melting temperatures of genetically engineered collagen-like proteins consisting of tandem repeats of the D1, D2, D3 or D4 collagen II periods revealed the presence of a gradient of thermostability along the collagen molecule with thermolabile N-terminal domains and thermostable C-terminal domains. These results imply a multi-domain character of the collagen triple helix. Assays of thermostabilities of the Arg75Cys and Arg789Cys collagen II mutants suggest that, in contrast to the thermostable domains, the thermolabile domains are able to accommodate amino acid substitutions without altering the thermostability of the entire collagen molecule.