含CD自杀基因腺病毒载体的构建及其应用

构建了含ＣＭＶ启动子、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ｃｄ）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶＣＤ）。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ鉴定证实,ｃｄ基因已克隆进入ＡｄＣＭＶＣＤ,并在受染细胞中表达。经氯化铯密度梯度离心法纯化的病毒滴度达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。经１００ｍ．ｏ．ｉ．的ＡｄＣＭＶＣＤ感染的ＨｅＬａ和Ｃ６细胞株在１００μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,细胞存活率＜２０％。同时也观察到ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统有很强的旁杀伤效应,将３．３％的ＡｄＣＭＶＣＤ受染细胞与９６．７％的野生型细胞混合,经５０μｍｏｌ／Ｌ５ＦＣ处理后,＞６０％的细胞被杀死。ＡｄＣＭＶＣＤ／５ＦＣ系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

HyTK基因转移联合ganciclovir对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤作用

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的过度增生主要是由于高度增生活性的成纤维细胞的数量异常增多及细胞外基质合成增加所致．用逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）的转移,随后应用药物９－（１,３－二羟基－丙氧基－甲基）鸟嘌呤（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）可选择性地杀死增生细胞．采用组织块贴壁法在体外原代培养成功增生性瘢痕病人的成纤维细胞（ＦＢ）．重组逆转录病毒ＧＴＫ转染ＦＢ细胞后,用ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ筛选出阳性细胞克隆（ＦＢ／ＧＴＫ）,经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入ＦＢ中,但不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＦＢ／ＧＴＫ及ＦＢ,光镜下观察不同时间后细胞形态变化及ＭＴＴ法检测细胞活性．结果表明,ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ时即对ＦＢ／ＧＴＫ有显著的杀伤作用,且具有强有力的“旁观者效应”     

光氧化胁迫下几种植物叶片的超氧自由基产生速率和光合特性

以甲基藉精（ＭＶ）Ｏ－１ｍｍｏｌ／Ｌ在１５００μｍｏｌ ｍ＾－２ａ＾－１光下处理Ｃ３植物花生、水稻和Ｃ４植物玉米、甘蔗的叶圆片３０ｍｍ,Ｏ２＾２＋产生速率随ＭＶ浓度提高而加快ＭＶ浓度超过１０μｍｏｌ／Ｌ,光合放氧出现负植并持续增大。光氧化作用降低叶绿素荧光参数ＦＶ／Ｆｍ,ΦＰＳⅡ和ｑｐ,而ｑＮ则或提高（Ｃ３植物,ＭＶ１０μｍｏｌ／Ｌ）或几平下）。热耗散系数ＫＤ的变化与ＱＮ相似。秘Ｃ４植物相比,Ｃ３     

重组腺病毒介导的白细胞介素—12（IL—12）在肝癌细胞中的表达

利用腺病毒表达系统在肝癌细胞中成功地表达了有生物活性的白细胞介素－１２（ＩＬ－１２）。ＩＬ－１２的Ｐ３５和Ｐ４０ ｃＤＮＡ分别克隆到腺病毒载体ｐＡＣＣＭＶ．ｐＬｐＡ,构建ｐＡＣ／Ｐ３５和ｐＡＣ／Ｐ４０表面质粒。与腺病毒重组质粒ｐＪＭ１７共转染２９３细胞,通过基因重组产生ＩＬ－１２Ｐ３５和Ｐ４０重组腺病毒。用重组腺病毒感染肝癌细胞株ＨｅｐＧ２和ＳＭＭＣ７７２１,经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ检测证明,     

利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示，应用ＨＳＶ－ＴＫ基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法     

HSV—tk／NAS系统基因治疗脑肿瘤中野生型腺病毒的检测及其安全性

在腺病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＮＡＳ系统脑肿瘤基因治疗研究过程中,建立了野生型腺病毒（ＲＣＡ）的检测系统,主要包括腺病毒Ｅ１区的ＰＣＲ以及野生型病毒的细胞病理效应观察这两种方法,ＰＣＲ的灵敏度为１个２９３细胞所含有的Ｅ１片段数。对基因治疗脑肿瘤所采用的重组腺病毒ＡｄＴＫ及其感染的细胞进行ＲＣＡ的检测,没有发现ＲＣＡ。通过离体实验首次发现,重组腺病毒对脑肿瘤细胞的杀伤作用明显高于正常的脑胶质细胞;大鼠     

选择适合表达 HBsAg 的哺乳动物细胞系

将含有重组ＨＢｓＡｇ的ｐＭＥＰ４表达性质粒转染ＨｅｐＧ２,ＣＨＯ,Ｃ１２７和ＣＶ１细胞,并用ＥＬＩＳＡ检测表达量,结果在ＨｅｐＧ２细胞中的表达量较高,在Ｃ１２７和ＣＶ１细胞中的表达量偏低,而在ＣＨＯ细胞中没有表达。     

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物９－（１,３－二羟基－丙氧基－甲基）鸟嘌呤（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）选择性地杀死肿瘤细胞．将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因,构建成重组逆转录病毒载体ＧＴＫ,转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞）,通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒．用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞,用ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ筛选出阳性细胞克隆（ＨｙＴＫ＋）,经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中,且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞,光镜下观察２４ｈ和４８ｈ后细胞形态及进行活细胞计数．结果表明,ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ时即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

乙肝病毒核衣壳启动子内三链DNA的形成

用电泳迁移分析方法研究了２１ｎｔ脱氧寡核苷酸Ｇ３ＴＧ２ＴＧＴ２Ｇ５ＴＧ２ＴＧＴ（ＣＰ１）与１２９ｂｐ的乙肝病毒（ＨＢＶ）核衣壳启动子（Ｃｐ）片段内一位点结合形成的三链ＤＮＡ的特异性及稳定性．在克隆有ＨＢＶ基因组的质粒ｐＣＰ１０的酶切产物中,ＣＰ１仅与含Ｃｐ的１２９ｂｐ片段结合．在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中其解离常数（Ｋｄ）为１．４×１０－７ｍｏｌ／Ｌ．不同离子稳定三链ＤＮＡ的效果依次为ｓｐ４＋（精胺）＞Ｍｇ２＋＞Ｚｎ２＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋,离子之间存在相互竞争作用．比ＣＰ１多一误配碱基的脱氧寡核苷酸Ｇ２ＴＧ２ＴＧＴＧ３ＴＧ２ＴＧ２ＴＧ２Ｔ（ＣＰ２）在２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇ２＋溶液中与Ｃｐ结合的Ｋｄ值约为ＣＰ１的１／７,而在６０ｍｍｏｌ／ＬＫ＋或５ｍｍｏｌ／ＬＺｎ２＋溶液中检测不到它与Ｃｐ的结合,这进一步显示了三链ＤＮＡ形成的特异性．细胞的生理离子浓度被认为是：Ｓｐ４＋１ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｍｇ２＋１０ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｋ＋１４０ｍｍｏｌ／Ｌ,因此,ＣＰ１在细胞内将能特异地与Ｃｐ结合并具有较好的稳定性．     

灵芝多糖对人脐血LAK细胞活性的影响

本文研究了灵芝多糖（ＧＬＰ）对人脐血ＬＡＫ（ＣＢ—ＬＡＫ）细胞活性的影响,结果发现,单独ＧＬＰ能刺激人脐血单个核细胞（ＣＢＭＣ）增殖,但不能诱导ＬＡＫ活性,当与５０ｕ／ｍｌｒＩＬ—２伍用时,可增殖ＣＢ—ＬＡＫ细胞诱导活性,不同剂量ＧＬＰ（０．５—１００μｇ／ｍｌ）影响作用不同,以１０μｇ／ｍｌ浓度最好．在不同浓度ｒＩＬ—２（１０—１００ｕ／ｍｌ）诱导ＣＢ—ＬＡＫ细胞过程中加入ＧＬＰ（１０μｇ／ｍｌ）,可明显提高细胞增殖能力,减少ｒＩＬ—２用量。ＧＬＰ亦能促进效应阶段ＣＢ—ＬＡＫ细胞对Ｒａｊｉ肿瘤靶细胞的杀伤作用（Ｐ＜０．００１）。由此看出,ＧＬＰ具有增强ＣＢ—ＬＡＫ细胞活性的作用,是一很好的生物反应调节剂（ＢＲＭ）,有必要进行深入的研究。     

转TK基因的人结肠癌细胞对多种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）的重组逆转录病毒载体ＬＴＫＳＮ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染人结肠癌细胞株ＬｏＶｏ．用Ｇ４１８筛选到稳定表达ＨＳＶ－ＴＫ基因的细胞克隆ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ,ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ与野生型ＬｏＶｏ细胞相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变,细胞毒试验证明ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ对ＧＣＶ的敏感性很高,半杀伤浓度ＩＣ５０为０．５μｍｏｌ／Ｌ,比野生型细胞提     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化和基本性质

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为ｐＨ８．３和ｐＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．０μｍｏｌ／Ｌ：Ｖｍａｘ为７６３０单位／毫克;ｋｏａｔ为９Ｓ－１。ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力对ＡＴＰ和Ａｒｇ的Ｋｍ分别为８．３ｍｍｏｌ／Ｌ和９９μｍｏｌ／Ｌ;Ｖｍａｘ为１６３２０单位／毫克;ｋｃａｔ为１８Ｓ－１。     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

丙型肝炎病毒C33_c单克隆抗体的研制和鉴定

用丙型肝炎病毒重组蛋白Ｃ３３_ｃ抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,运用杂交瘤技术成功地建立了７株能稳定分泌抗Ｃ３３_ｃ单克隆抗体的杂交瘤细胞１Ｈ６Ｄ２、２Ｇ１Ａ６、３Ａ４Ａ８、３Ｅ３Ｅ７、４Ｇ１２Ｃ１０、４Ａ１０Ｃ２、５Ｆ４Ｂ６．试验结果表明,７株ＭｃＡｂｓ具有良好的ＨＣＶ特异性,间接ＥＬＩＳＡ法测得小鼠腹水ＭｃＡｂ效价为１：１０￣４－１：４×１０￣４;竞争抑制实验和相加指数测定证实７株ＭｃＡｂｓ识别相关的抗原表位;７株ＭｃＡｂｓ中１株为ＩｇＭ（５Ｆ４Ｂ６）,其它６株为ＩｇＧ（２ａ）。     

炎症介质对离体大鼠肠系膜动脉降钙素基因相关肽释放的影响

本工作目的是在离体大鼠肠系膜动脉床灌流模型上,观察几种常见炎症介质：前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）、缓激肽（ＢＫ）、组胺（ＨＩＳ）、血小板活化因子（ＰＡＦ）及５－羟色胺（５－ＨＴ）对血管周围感觉神经介质ＣＧＲＰ释放的直接影响。结果显示：ＰＧＥ２（１－１００μｍｏｌ／Ｌ）和ＢＫ（５－１０μｍｏｌ／Ｌ）能引起大鼠肠系膜动脉床时间和浓度依赖性地释放ＣＧＲＰ。ＨＩＳ,ＰＡＦ和５－ＨＴ则未见明显作用。结果提示,ＰＧＥ２与ＢＫ可能是引起血管周围感觉神经兴奋和ＣＧＲＰ释放的主要炎症介质。     

玉米花粉低分子量ATP酶部分性质研究

对纯化的玉米花粉低分子量ＡＴＰ酶－３８ｋＤ蛋白的部分理化及药理学性质进行了研究。该酶与植物细胞中现已发现的马达蛋白（动蛋白及ｄｙｎａｍｉｎ）存在较大差异。紫外吸收光谱在２７８ｎｍ处有最大吸收。圆二色谱分析表明该蛋白呈现典型球蛋白特征。最适ｐＨ为８．０,对ＡＴＰ的Ｋｍ为８×１０－４ｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为３．５μｍｏｌＰｉ每ｍｉｎ每ｍｇ蛋白质。对ＮＴＰ底物专一性为ＣＴＰ＞ＡＴＰ≥ＧＴＰ＞ＩＴＰ＞ＵＴＰ,药理学研究表明：该酶对０．１ｍｍｏｌ／ＬＮａ３ＶＯ４、２．４ｍｍｏｌ／ＬＮａＦ及０．１ｍｍｏｌ／ＬＮＥＭ均非常敏感。     

细胞松弛素B促微丝解聚对DNA合成的作用

利用微丝（ＭＦ）解聚药物细胞松弛素Ｂ（ＣＢ）处理Ｇ０期小鼠Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２成纤维细胞,对Ｇ０至Ｓ期ＤＮＡ合成,胸腺嘧啶核苷激酶（ＴＫ）活性、ＴＫ基因表达、钙调素（ＣａＭ）水平和一些细胞周期早期基因的表达进行了观察。Ｇ０期细胞经３ｍｇ／ＬＣＢ处理２ｈ,促ＭＦ解聚增强了血清对Ｓ期细胞ＴＫ活性、ＴＫ基因表达和ＤＮＡ合成的刺激作用,并促进细胞提前进入Ｓ期。血清刺激Ｇ０期细胞进入晚Ｇ１期和Ｓ期时,ＣａＭ     

丹皮酚对心肌细胞自律性和延迟后除极的影响

目的与方法：采用常规玻璃微电极技术研究丹皮酚对离体心肌细胞自律性（ＡＭ）、延迟后除极（ＤＡＤ） 及触发活动（ＴＡ）的影响。结果：１．８×１０－４ｍｏｌ／Ｌ丹皮酚灌流组,肾上腺素（Ａｄｒ）的阈浓度空白对照组为（１．２８±０．５７）μｍｏｌ／Ｌ,药后为（１．５６±０．５３）μｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝９,Ｐ＞０．０５）;用（１．８×１０－ ３） ｍｏｌ／Ｌ丹皮酚（Ｐａｅ）灌流组,Ａｄｒ 浓度由空白对照组的（１．２２ ±０．６２）μｍｏｌ／Ｌ升高到（６．２２±２．１１）μｍｏｌ／Ｌ（ｎ＝９,Ｐ＜０．０１）。１．８×１０－３ｍｏｌ／Ｌ的Ｐａｅ 能明显抑制哇巴因（Ｏｕａ）诱发的ＤＡＤ的幅值,当基本刺激周长为５００,４００,３００ 和２００ ｍｓ 时,其ＤＡＤ幅值从（５．５±２．０）ｍＶ,（７．３±２．１）ｍＶ,（８．０ ±２．４）ｍＶ和（９．２±１．９）ｍＶ减小到（３．０±１．１）ｍＶ、（３．６±１．７）ｍＶ,（４．３±２．０） ｍＶ和（５．９ ±１．６） ｍＶ,Ｐ＜０．０１。当基本刺激周长为２００ ｍｓ时,ＴＡ 数目由５．５±１．０ 降至０．７±０．３（Ｐ＜０．０１）。结论：丹皮酚能抑制心肌细胞ＡＭ、ＤＡＤ及ＴＡ,具有抗心律失常作用     

细胞转化过程中胞内钙离子浓度的变化

使用钙离子荧光探针Ｆｌｕｏ－３ＡＭ和ＤＮＡ荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２联染细胞的方法,利用显微分光光度计ＭＰＶⅡ测量了两种温度敏感细胞—６Ｍ２和ｔｓＲＳＶＮＩＨ３Ｔ３－ＬＡ９０细胞及Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２和转化Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２细胞在不同细胞周期时相内钙的浓度,发现从Ｇ１期到Ｓ期到Ｇ２期,６ｍ２细胞当在３３℃培养时（转化状态）胞内钙的浓度〔Ｃａ＾２＋〕ｉ分别为８５．０,１３８．４２３９．０ｎｍｏｌ     

人肝癌细胞的IGF—BP1分子特性及内源性蛋白酶对其降解的研究

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、高效液相色谱（ＨＰＬＣ）、质谱等方法,研究了人肝癌细胞（ＨｅｐＧ２）分泌的胰岛素样生长因子结合蛋白－１（＾３５Ｓ－ＩＧＦ－ＢＰ１）的分子结构、特性,及其被内源性蛋白酶降解的特点,＾３５Ｓ－ＩＧＦ－ＢＰ１的经抗体免疫沉淀、生化分离,纯化为均一体,其分子是由多个亚构成的蛋白质,分子量约为２７ｋＤ;细胞ＵＭＲ、ＨｅｐＧ２、Ｈ３５ＢＲＬ３Ａ分泌的蛋白酶能将＾３５Ｓ－ＩＧＦ－ＢＰ１催