优化外源基因在大肠杆菌中表达的翻译起始率的策略和方法(英文)

ｍＲＮＡ的翻译起始区（ＴＩＲ）的二级结构对翻译起始率有很大的影响。本文建立了一种改进外源基因在大肠杆菌中翻译起始率的系统。以人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因为模型,将ＰＣＮＡ基因５′端编码区的１１４ｂｐ的顺序插入质粒ｐＴＺ１９Ｒ中ＬａｃＺ′的５′端构成融合基因。用定点突变法在ＰＣＮＡ的ＡＵＧ的８位插入一个Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）顺序ＧＡＧＧＴ,再以合成的带部分随机序列寡核苷酸作引物,用ＰＣＲ法在ＳＤ顺序两侧,即ＳＤ上游６个碱基和ＳＤ与ＡＵＧ之间７个碱基,进行随机突变,它们与结构基因５′端序列形成各种可能的翻译起始区（ＴＩＲ）二级结构。重组质粒转化大肠杆菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）,５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′ｍＲＮＡ可通过诱导表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶而得到专一而有效的转录。通过在Ｘ－ｇａｌ板上蓝色筛选以及随后的杂交鉴定,共得到２６９个５′ＰＣＮＡ－ｌａｃＺ′融合质粒。从中选择８个不同蓝色的重组子进行β－ｇａｌ活性测定,结果表明它们的酶活性相差在２０倍以上。而ＲＮＡ点杂交表明它们在转录水平无明显的差异。由此提示,通过此策略和方法能得到一个在大肠杆菌中能高效表达的翻译起始区。     

人分裂细胞核抗原基因片段的筛选、测序及对启动子的分析

经６．６×１０５个克隆筛选,从装在λ噬菌体载体Ｃｈａｒｏｎ３０中的人基因库中筛选到了一个含人分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因的克隆。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析插入基因长约１４ｋｂ,有较长的５＇上游区,但３＇端缺少一部分。经亚克隆和测序已确定从５＇上游１２６３ｂｐ到３＇端与λ载体接点共４９６９ｂｐＰＣＮＡ基因片段的核苷酸序列。将ＰＣＮＡ基因启动子核苷酸序列与ＤＮＡ聚合酶α,拓扑异构酶Ⅱα,胸苷酸激酶基因的启动子进行比较有３０％以上同源性,具有“看家基因”特征。在转录起始点的５＇上游几百ｂｐ的范围内都有与ＣＡＴ,ＳＰ１,Ｅ２Ｆ,ＮＦＨＢ,Ｏｃｔ１和ＡＴＦ等转录因子的结合位点相似的核苷酸序列。     

硫代反义寡核苷酸在细胞培养内抗甲型流感病毒活性

为了研究抗流感病毒特异性反义核酸药物,针对Ａ型流感病毒基因组３＇和５＇端保守序列,设计并合成了４条硫代寡核苷酸（ＯＤＮ）：３＇端反义ＯＤＮ（ＩＶ３＾＃）与３＇端正义ＯＤＮ（ＩＶ３Ｓ）,５＇端反义ＯＤＮ（ＩＶ４＾＃）与５＇端正交ＯＤＮ（ＩＶ４Ｓ）。以流感病毒血凝滴度和致细胞病变作用为指标,测定了ＯＤＮｓ在ＭＤＣＫ细胞中对Ａ型流感病毒Ａ／京防／８６－１（Ｈ１Ｎ１）复制的影响。结果表明,与流感病毒基因组     

HCV5＇端非编码区cDNA的体外转录

采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从广东省一例慢性丙型肝炎病人血清中获得丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇端非编码区（５＇ＮＣＲ）３０２ｂｐ的ｃＤＮＡ片段,经补齐和提纯后插入ｐＵＣ１９质粒,获得的重组体ｐＵＮ进行序列测定。将ｐＵＮ的目的基因亚克隆进体外转录载体ｐＳＰＯＲＴＩ多克隆位点的ＥｏｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点之间,所得重组体ｐＳＮ线性化后由Ｔ＿７ＲＮＡ多聚酶及ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶引导体外转录反应,产物经凝胶电泳及特异引物ＲＴ－ＰＣＲ,证实ＳＰ６引导的是正义ＲＮＡ,Ｔ７合成的是反义ＲＮＡ,其大小分别力４２９ｂｐ和３６２ｂｐ。并证实所得ＲＮＡ力ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ转录而来。获得的ＨＣＶ５＇ＮＣＲｃＤＮＡ和ＲＮＡ在常规逆转录和ＰＣＲ步骤中用于设立有效的模板对照,对消除假用性及评估试剂有重要意义。同时,ＨＣＶ５＇ＮＣＲ体外转录载体的构建可用于制各ＲＮＡ探针和反义ＲＮＡ,改进后还可作为定量ＰＣＲ的竞争性模板。     

5’端非翻译区对LT—B基因表达的影响

ｍＲＮＡ５＇端非翻译区的不同结构可影响基因表达,为了改善编码人毒素源性大肠杆菌热敏感肠毒素Ｂ亚单位的ＬＴ－Ｂ基因的表达水平,我们把该基因置于ｐＢＶ２２０载体的ＰＲＰ１串联启动子游,构建了带有不同核苷酸组成的５＇端非翻译区重组体。这些重组体。这些重组体分别在大肠杆菌ＨＢ１０１和ＤＨ５ａ中表达。结果表明,起始密码前有两个连续串联ＳＢ序列的ＬＴ－Ｂ基因的表达水平低于只有单个ＳＤ序列下的表达水平,而翻译偶     

水稻蜡质基因5＇上游区缺失对基因表达的影响

为研究水稻蜡质基因（ｗａｘｙ）５＇上游调控区中存在的顺式作用元件,我们将水稻ｗａｘｙ基因翻译起始声、（ＡＴＧ）５＇上游３．４ｋｂ（－２１１８～＋１２９１ｂＰ）片段经外切核酸酶ＥｘｏⅢ部分酶解,得到一系列５＇端缺失的片段。将这些缺失片段分别与ｇｕｓ基因编码区连接,构建成融合质粒,经ＰＥＧ介导引入水稻原生质体,２６℃培养４８ｈ后,定量测定ＧＵＳ酶活力,并以同时导入的由３５Ｓ启动子指导的荧光素酶（ＬＵＣ）基因表达的酶活力作为内对照。结果表明,ＧＵＳ酶活性随５’上游调控区长度的减少而逐渐减弱。由─８６１ｂｐ缺失至─６４０ｂＰ时,ｇｕｓ基因表达水平有较明显的降低,推测在该区域中可能存在一个顺式作用元件区。     

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用ＣＯＳ７细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达的影响。通过ＤＮＡ重组技术,构建了原ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达载体ｐＣＳＶ－ＥＰＯ（１）,其转译起始序列为５＇ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成５＇ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３＇,而构建了另一表达载体ＰＣＳＶ－ＥＰＯ（２）。后经序列分析证明无误后和前均通过ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞上清,测定结果为     

优化mRNA翻译起始区提高人粒－巨噬细胞集落刺激因子在E．coli中的表达

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子．利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ））,另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））．经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定,证明两者均能表达特异性的１４．６ｋＤｈＧＭ－ＣＳＦ,但ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）的表达水平较ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ）提高了１．２６倍,占菌体总蛋白的１６．９％．ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测分析表明,优化突变后生成自由能ΔＧ从原来的－１０．２提高至－９．４Ｋｃａｌ,ＡＵＧ从部分配对状态变为非配对状态．     

组织纤溶酶活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂（ｔＰＡ）是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体－长效组织纤溶酶原激活剂（ＬＡｔＰＡ）的ｃＤＮＡ作为目的基因,将它插入羊β－乳球蛋白（ＢＬＧ）基因起始密码之前,使ＬＡｔＰＡ的转录、翻译受控于ＢＬＧ基因的５＇、３＇序列,再将所构建的ＢＬＧ－ＬＡｔＰＡ用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹鉴定,获得２只ＬＡｔＰＡ基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有     

mRNA翻译起始区的结构改变对几个外源基因翻译的影响

为观察ｍＲＮＡ翻译起始区结构与基因表达的关系,利用密码子的简并性,在不改变表达产物氨基酸序列的前提下定点突变几个外源基因的５′端若干位点,使基佤表达载体重组后转录形成的ｍＲＮＡ翻译起始区结构发生改变。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等分析证实这些改变大大提高了外源基因的表达水平,ＲＮＡｄｏｔｂｌｏｔ表明突变与非突变基因转录水平差别不大,表达水平的提高主要由于翻译效率的提高,ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测提示其生     

编码Synechococcus sp. PCC 7002 FNR 中FNR区的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ的方法克隆出了编码蓝细菌Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＰＣＣ７００２ＦＮＲ中ＦＮＲ区的基因ｐｅｔＨＬ,克隆到达载体ｐＥＴ３ａ上,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后实现了大量表达。重组ＦＮＲ区（ｒＦＮＲＤ）经ＤＥＡＥＳｅｐｈｄｅｘＡ５０离子交换层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００凝胶层析得到大量的电泳均一的ｒＦＮＲＤ。Ｎ末端氨基酸序列分析表明,表达产物确为ｐｅｔＨＬ所编码。且起始Ｍｅｔ翻译后未被除去。ｒＦＮＲＤ与ｒＦＮＲ的吸收光谱相同,其黄递酶活性的最适ｐＨ和最适温度也相同。ｒＦＮＲＤ能在体外催化电子从Ｐ７００到ＮＡＤＰ＋的传递     

小麦丛矮病毒NS蛋白基因的克隆及序列分析

利用与Ｎ蛋白ｍＲＮＡ３＇末端顺序相同的２０寡聚核苷酸引物,通过点杂交、限制性内切酶分析从小麦丛矮病毒（ＷＲＳＶ）ｃＤＮＡ文库中筛选到编码Ｎ蛋白基因下游顺序的ｃＤＮＡ克隆。序列分析表明,该ｃＤＮＡ片段含有一编码的４０ｋＤ蛋白的开放读框。将该读框的全长ｃＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后,克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经蛋白质印迹鉴定,该基因为小麦丛矮病毒ＮＳ蛋白基因。     

优化mRNA翻译起始区提高人粒—巨噬细胞集落刺激因子在E.coli…

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子。利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ））,另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））。经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ等未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））。经酶切电泳、Ｄ     

金属硫蛋白突变体的植物高效表达载体的构建及其在烟草中的表达

金属硫蛋白有α、β两个结构域（ｄｏｍ ａｉｎ）,其中α结构域优先结合Ｃｄ２＋ 和Ｈｇ２＋ ．小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Ｃｄ３００（３００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用ＰＣＲ 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ＡＴＧ 附近加入植物偏爱的碱基组合ＡＡＣＡＡＴＧ．另外,将该突变体基因插入具有双３５ Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）强启动子的植物双元表达载体ｐＧＰＴＶｄ３５Ｓ－ＢＡＲ中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体．通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草ＮＣ８９,获得了抗除草剂的转基因植株．经ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 和蛋白Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达．抗重金属实验证明转基因烟草可以在Ｃｄ４００（４００ μｍ ｏｌ／Ｌ）中生长．     

非连续多核苷酸定点突变的方法

以人粒巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ-ＣＳＦ）、人α８干扰素（ｈＩＦＮ-α８）和分裂细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的ｃＤＮＡ定点突变为例,建立了一种新的大区域非连续多核苷酸同步定点突变的方法。经碱变性后的质粒ＤＮＡ,先用突变引物延伸单链,然后通过ＰＣＲ扩增得到突变双链ＤＮＡ。用该方法成功地改造了ｈＧＭ-ＣＳＦ基因５′端３６个核苷酸中的９个位点、ＩＦＮ-α８基因５′端３９个核苷酸中的９个位点和ＰＣＮＡ基因ＳＤ顺序两侧６个和７个核苷酸。与经典的含Ｕ单链寡核苷酸定点突变方法相比,本方法突变效率高,并省去了对突变克隆杂交筛选的操作     

编码大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的基因（argS）拥？…

编码大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）的基因（ａｒｇＳ）和编码亮氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＬｅｕＲＳ）的基因（ＬｅｕＳ）分别插入ｐＵＣ１８后,各自在Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１转化子中的表达有很大的差异（高表达倍数分别为１０００和３５倍）。为了调查造成其表达差异的原因,用ａｒｇＳ的５＇上游非编码区取代ｌｅｕＳ的５＇上游非编码区,构建了融合基因ｐａｒｇ－ｌｅｕＳ;将它插入质粒ｐＵＣ１８     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

重组人MCAF／GM－CSF融合蛋白表达及其生物学活性研究

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）进行基因融合,置于ｐＢＶ２２０载体的λＰＲＰＬ串联启动子下游,构建了ＳＤ序列与ＡＴＧ之间含有不同核苷酸组成的重组质粒ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３。ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但ＤＨ５α（ｐＭＧ０２、ＤＨ５α（ｐＭＧ０３）的表达水平远远高于ＤＨ５α（ｐＭＧ０１）,ＤＨ５α（ＰＭＧ０１）几乎没有表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,它能分别与ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持ｈＧＭ－ＣＳＦ依赖的ＴＦ１细胞生长的特性,说明ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ的生物学功能是相容的．     

酵母豆蔻酰辅酶A：蛋白质N端转酰基酶基因的克隆与表达

利用ＰＣＲ技术,从酵母染色体中扩增得到酵母豆蔻酰－ＣｏＡ：蛋白质Ｎ端转酰基酶（ＹＳＣＮＭＴ）基因,并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋载体中。由ＤＮＡ全序测定表明,获得了ＹＳＣＮＭＴ编码基因。进一步构建了Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下的含上述完整ＹＳＣＮＭＴ编码基因的表达质粒ｐＭＦＴ７－５－ＮＭＴ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,观察到一与理论分子量一致的诱导条带（约５３ｋＤ）,占全菌蛋白的３９％左右,且可溶性部分约占上清液中全部蛋白的３４％。经一步Ｐ１１磷酸纤维素阳离子交换柱层析,将其纯化到纯度达９７％以上．纯化的表达产物经Ｎ端氨基酸序列分析,所测定的Ｎ端５个氨基酸的序列,与从克隆的ＹＳＣＮＭＴ基因推出的氨基酸序列完全一致（不含Ｎ端Ｍｅｔ）。对所得的ＹＳＣＮＭＴ进行酶活力鉴定,观察到了明显的活力。     

神经营养因子GDNF编码顺序的克隆及表达产物的纯化

根据基因库中的顺序,设计了胶质细胞源神经营养因子（ＧＤＮＦ）基因的ＰＣＲ引物,以此从人基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了ＧＤＮＦ的编码序列,经ＤＮＡ测序确认后,该片段克隆到表达质粒ｐＥＴ－３ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）．培养的重组菌经ＩＰＴＧ诱导,在Ｔ７启动子调控下表达出ｈＧＤＮＦ蛋白．经电泳分析表明ＧＤＮＦ主要存在于细菌包涵体中．从培养菌中制备包涵体,经充分洗涤,溶解于含８ｍｏｌ／Ｌ尿素的变性缓冲液中．经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析分离,梯度洗脱,以１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检查含ＧＤＮＦ的部分．将含单体ＧＤＮＦ部分进行复性,再次用ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子柱分离同源二体ＧＤＮＦ．最后经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ制备电泳纯化,纯度大于９５％．经Ｎ端测序表明序列正确．经测定,每升培养菌可得约１０ｍｇ纯化的ＧＤＮＦ．