江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的溶血位点

用聚合酶链式反应 (PCR)对江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 基因进行点突变 ,使对应 34位氨基酸残基由Arg分别突变为Glu和Gln ,将其基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2 ,并在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 ,表达产物以包涵体的形式存在。对包涵体进行变复性后 ,用凝胶过滤的方法纯化。对纯化后的产物进行酶活力测定及溶血活性测定。实验结果表明 ,突变后的表达产物维持原有磷脂酶A2 活性 ,且溶血活性显著降低 ,表明磷脂酶A2 的34位碱性氨基酸残基在溶血过程具有重要作用     

重组人白细胞介素-6的纯化

重组人白细胞介素－６（ｒｈＩＬ－６）在工程菌ｐＢＶ２２０／ｒｈＩＬ－６／ＤＨ５ａ中以包涵体形式高效表达。ｒｈＩＬ－６经过工程菌体破碎、包涵体分离及抽提、复性、色谱分离后得到高度纯化。纯化产物纯度９５％,具有良好的生物学活性     

大肠杆菌表达的重组人GM-CSF的纯化

本文对重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)高效表达克隆pZW.GM的表达产物进行纯化,并对纯化的人GM-CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM-CSF基因表达产物在大肠肝菌中以不溶性包涵体形式存在,经超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99％,按蛋白总量计算回收率达10％,比活性达1×10~7u/mg蛋白质。通过测定纯化人GM-CSF的N端16个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。     

原核基因工程中的包涵体

包涵体是原核基因工程的特有产物,其中表达的蛋白产物是以无活性、不溶解的形式存在。包涵体特性、蛋白回收及活性恢复是生物工程研究的重要课题。文章对包涵体特性、回收及产物提取,重组蛋白的复性及纯化作了综述。     

重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经大肠杆菌温度诱导表达后,其表达产物以包涵体形式存在,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF.在一定的实验条件下用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,所得修饰产物经分离纯化后获得PEG20K-rhG-CSF偶联物.与修饰前的rhG-CSF相比较,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高.     

破骨细胞形成抑制因子TNFR结构区在大肠杆菌中表达、抗体制备及活性测定

破骨细胞形成抑制因子(OPG)对骨的重建与再吸收有重要调节作用,其TNFR结构区行使抑制破骨细胞形成与活性的功能。通过PCR将该区基因片段克隆出来,插入表达载体PET-28a质粒多克隆位点,重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行表达,表达产物以包涵体形式存在,包涵体经变性复性后,亲合层析获得重组蛋白。纯化的产物作为抗原免疫兔,得到较高特异性的兔源多克隆抗体。利用小鼠降血钙实验检测变性复性后产物的活性,结果表明该重组蛋白有一定的生物活性。     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

乙肝表面抗原a表位粘膜疫苗的构建及免疫原性检测

利用DNA重组技术 ,构建霍乱毒素B亚单位与乙肝病毒表面抗原a表位的融合基因 ,并在大肠杆菌表达体系pET 30a BL2 1 (DE3)中获得以包涵体形式的高效表达。免疫印迹表明表达产物具有免疫学活性 ,包涵体复性后 ,表达产物能够象CTB那样形成五体 ,以腹腔注射、灌胃、鼻饲形式免疫小鼠均能产生抗HBsAg抗体     

重组人RGD-sTRAIL的表达、纯化及抗肿瘤活性研究

利用PCR技术构建RGD短肽与人肿瘤坏死因子凋亡配体(胞外区114-281)的融合基因,将该DNA片段克隆到原核表达载体pET-11a中。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后可表达相对分子质量约为20000的目的蛋白,占菌体蛋白的20％左右,且大多数重组蛋白以不溶的包涵体形式存在。Western印迹表明目的蛋白具有人sTRAIL的抗原性。表达产物经变性、复性、离子交换层析和分子筛等步骤,可以得到纯度大干95％的RGD-sTRAIL重组蛋白。肿瘤细胞体外实验发现,纯化后的RGD-sTRAIL重组蛋白能明显抑制人肺癌细胞A549生长,并呈剂量依赖性。研究结果表明,通过复性,包涵体中的RGD-sTRAIL蛋白得到正确的折叠,并在体外具有杀伤肿瘤细胞的活性,从而为进一步研究体内靶向性杀伤肿瘤细胞奠定了基础。     

集成干扰素突变体IIFN72C的构建及其聚乙二醇定点修饰

目的：设计构建集成干扰素突变体IIFN72C并进行聚乙二醇定点修饰,以获得高活性的长效干扰素分子。方法：利用蛋白质分子同源模建,选择在集成干扰素分子IIFN的第72位引入半胱氨酸残基构成集成干扰素突变体IIFN72C。诱导表达后经包涵体变复性和层析纯化,与单甲氧基聚乙二醇（mPEGMAL）定点偶联。修饰产物经纯化后,以SDSPAGE考察其纯度,用WISHVSV系统进行生物活性测定。结果：IIFN72C以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,比活性与突变前相当;修饰产物大多数为单修饰体,纯化后纯度大于98%,比活性保留约为修饰前的8%。结论：成功设计并表达IIFN72C用于PEG定点修饰,修饰产物活性保留得以提高。     

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究*

推测人骨形成蛋白-3羧基端的127氨基酸的肽段为其成熟肽(hRMP 3m)。将编码此成熟肽的cDNA插入含PL启动子的表达质粒pDH中,构建表达质粒pDH-B-3m,转化大肠杆菌DH5α。42℃热诱导6h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白28％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后．溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在95％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白3成熟肽(rhBMP－3m)植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的rhBMP－3m具有明显的异位诱骨活性。     

颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

为高效表达颗粒裂解肽G13结构域并避免G13对宿主菌的毒性, 将人工合成的编码G13的基因片段, PCR扩增后克隆于原核表达载体pThioHisA中, 构建了重组表达载体pThioHisA-G13, 将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中, 经IPTG诱导表达融合蛋白Trx-G13, 表达产物以包涵体的形式存在, 其表达量约占细菌总蛋白的58%。包涵体蛋白经 8 mol/L尿素溶解后, 再经CNBr切割, 阳离子交换层析, 得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。     

重组人白细胞介素4的纯化及N端氨基酸序列分析

本文对重组人白细胞介素4高效表达克隆pBV220/hIL-4a的表达产物进行了纯化,升对纯化的人IL-4进行了N端氨基酸序列分析。人IL-4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、复性浓缩、离子交換和凝胶过滤层析一系列纯化步骤,终产物纯度达98％以上,按蛋白总量计算回收率为14％,比活性达2×10~6单位/mg蛋白。通过测定纯化人IL-4的N端16个氮基酸序列,与由其DNA序列推导的氨基酸序列完全一致。本文为重组人IL-4的批量生产奠定了基础。     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 (A .aBPLA2 )基因克隆至温敏表达载体 pBLMVL2 ,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 .表达产物A .aBPLA2 约占细菌蛋白质总量的 2 0 % ,并以包涵体的形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用FPLCSuperoseTM12纯化 ,产物经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带 .对纯化后的表达A .aBPLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,表达A .aBPLA2的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A2 酶活性相近 ,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A2 的溶血活性 ,没有抑制血小板聚集活性 .最后对磷脂酶A2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(rhGM—csF)高效表达克隆pzw．GM的表达产物进行了纯化,并对纯化的人GM—CSF进行了N端氨基酸序列分析。人GM—CSF基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列纯化步骤,终产物纯度达99％,按蛋白总量计算回收率达10％,比活性达1×10⁷／mg蛋白质。通过测定纯化人GM—csF的N端l 6个氨基酸序列,与由其DNA序列推导的氮基酸序列完全一致,为大批量重组人GM—CSF的生产创造了条件。     

人促红细胞生成素受体胞外区基因的克隆及其在大肠肝菌中的表达

以人胎肝为材料,通过ＰＴ－ＰＣＲ的方法扩增出人促红细胞生成素受体（ｈＰｅｏＲ）的胞外区基因。将获得的或熟体胞外区基因起始密码子改构后克隆原核表达载体ｐＢＶ２２０中,进行原核温控诱导表达。表达产物经蛋白Ｎ端测序及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验证实表达产物是ｈＥｐｏＲ胞外区蛋白。利用上罐发酵培养获得的包涵体蛋白经复性纯化后,体外生物学活性检测表明表达产物可特 抑制ＴＦ－１细胞在Ｅｐｏ刺激下的生长,证实了     

人Leptin基因在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV220-OB转化E.coliJM109,经热诱导获得了目的蛋白的表达。经SDS-PAGE鉴定分析,表达产物以包涵体形式存在,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上。通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/mg的高纯度的重组人Leptin。Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异性结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致。纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键。体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性。     

蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase在大肠杆菌中的表达、纯化及活性检测

目的:应用大肠杆菌表达系统表达纤溶性蛇毒金属蛋白酶Alfimeprase。方法:运用PCR技术扩增人工合成的目的基因,引入Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切位点;目的基因经Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切后,克隆到pET22b载体上,然后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行胞内表达,对获得的包涵体进行体外透析复性;应用纤维蛋白原水解法、纤维蛋白平板法和纤维蛋白层叠法检测复性后蛋白的降纤活性。结果:目的蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中获得高表达,复性后的蛋白具有降解纤维蛋白(原)的活性。结论:Alfimeprase包涵体可以通过复性获得活性产物。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因的克隆、表达与生物活性鉴定

目的：研究重组人组织型纤溶酶原激剂突变体(reteplase,r-PA)基因的克隆和表达,并对表达产物进行活性鉴定。方法：通过PCR的方法从t-PA基因上扩增得到r-PA基因的编码序列,并克隆到pUC19载体中,经DNA测序正确后,将该基因克隆到含有,T7启动子的高效表达质粒pJZ-100中,转化E．coli BL21(DE3),得到含有r-PA基因的工程菌。工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况。提取包涵体,经过体外稀释法复性,亲和色谱层析纯化,测定产物的活性。结果：表达的重组蛋白约占可溶性总蛋白的20％,复性并纯化后测定活性为58000IU/mg。结论：成功构建了重组r-PA的表达质粒,表达产物具有良好的生物活性。     

重组人粒细胞集落刺激因子的纯化

重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）在工程菌ｐＣＧ－１／ｒｈＧ－ＣＳＦ／ＤＨ５ａ中以无活性的包涵体形式大量表达。经过菌体破碎分离包涵体、包涵体变性复性后,ｒｈＧ－ＣＳＦ的活性得到恢复。用离子交换和疏水层析纯化了ｒｈＧ－ＣＳＦ,比活性达１．５７×１０８ｕ／ｍｇ,纯度大于９８％。