丙型肝炎病毒PNA打点杂交检测方法同RT—PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５＇端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ折方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异的检出血清中ＨＣＶ ＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法     

同时抽提DNA和RNA的简便方法

同时抽提ＤＮＡ和ＲＮＡ的简便方法刘定干（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词ＤＮＡＲＮＡ抽提在研究工作中,常同时需要培养细胞的ＤＮＡ和ＲＮＡ,从同一样品中同时提取ＤＮＡ和ＲＮＡ。目前,已有好几种同时抽提ＤＮＡ和ＲＮＡ的方法［１～４］。作...     

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶基因克隆与原核表达

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶（ＲｄＲｐ）是参与病毒基因组ＲＮＡ复制的一个关键蛋白因子,是研究抗ＨＣＶ新型药物的重要靶标,获得纯化的ＲｄＲｐ产物是建立靶向ＲｄＲｐ药物高通量筛选体系和抗病毒药物研究的关键步骤。以ＨＣＶ病毒基因组全长ｃＤＮＡ质粒（ｐ９０／ＨＣＶ ＦＬ－ｌｏｎｇ ｐＵ）为模板,设计了特异性扩增ＲｄＲｐ的引物,通过ＣＰＲ扩增获得编码ＲｄＲｐ的基因。将该基因克隆到Ｔ载体中     

小量快速RNA,DNA提取研究耐药株中GSTЛ及癌基因的表达

本文采用一种小量快速ＲＮＡ制备法（硫氰酸胍－酚,氯仿／异尤戊醇－液氮）和ＤＮＡ－ＲＮＡ联合提取法（硫氰酸胍－酚,氯仿／异戊醇－液氮法）,提取ＲＮＡ和同一样本中ＤＮＡ与ＲＮＡ,同时采用一种快速液相杂交法,通过标记探针与样品ＤＮＡ或ＲＮＡ经变性－复性杂交,凝胶电泳,凝胶抽干,放射自显影。经用本法研究Ｐ３８８／ＡＤＲ耐药株中的ＧＳＴπ及三种癌基因表达表明：耐药株中的ＧＳＴπ较敏感株增加１．５６倍（ｐ＜０     

乙型肝炎病人重叠感染丙型肝炎的评价

应用ＥＬＩＳＡ和ＰＣＲ法检测５０２例乙肝病人血清,４０１例ＨＢｓＡｇ阳性血清中,有１１４例（２８．４％）抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ双项阳性,２５例（６．２％）ＨＣＶＲＮＡ单项阳性;２１例（５．２％）抗－ＨＣＶ单项阳性。将ＨＢｓＡｇ乙肝病人分成ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阳性组和ＨＢＶＤＮＡ,ＨＢｅＡｇ阴性组。前者抗－ＨＣＶ阳性率为１１．６％～２０．５％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为１６．２％～２０．５％。后者抗－ＨＣＶ阳性率为２０．２％～５５．６％,ＨＣＶＲＮＡ阳性率为２３％～６０．３％。结果说明长期携带ＨＢＶ者和慢性乙肝病人均可重叠ＨＣＶ感染。ＨＢＶＤＮＡ阳性组抗－ＨＣＶ和ＨＣＶＲＮＡ阳性率明显高于ＨＢＶＤＮＡ阳性组     

人GRY-RBP基因的表达及其RNA结合活性的初步鉴定

ＲＲＭ ＲＮＡ 结合蛋白在基因的转录后调控中起着重要作用．人ＧＲＹ－ＲＢＰ 是我们实验室最近克隆的一个新的全长ｃＤＮＡ,编码一个ＲＲＭ ＲＮＡ 结合蛋白．ＧＲＹ－ＲＢＰ 的全编码区用ＰＣＲ扩增后,克隆到ｐＥＴ３０ａ＋ 表达载体中,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得了高效表达,表达的ＧＲＹ－ＲＢＰ重组蛋白占细菌总蛋白的２１％ ．利用融合在ＧＲＹ－ＲＢＰＮ 端的Ｈｉｓ．Ｔａｇ,采取亲和层析的方法纯化了表达的重组蛋白．为了检测ＧＲＹ－ＲＢＰ的ＲＮＡ 结合活性及其所结合的ＲＮＡ 性质,将表达的蛋白与ｐｏｌｙ（Ａ）－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ结合,发现ＧＲＹ－ＲＢＰ能与ｐｏｌｙＡ （Ａ）结合,结合活性能被可溶性的ｐｏｌｙ（Ａ）、ｐｏｌｙ（Ｃ）减弱．改变ＮａＣｌ浓度和加入不同浓度的酵母ｔＲＮＡ竞争物后,ｐｏｌｙ（Ａ）结合活性不变．     

黄瓜花叶病毒山东株（CMV—SD）RNA2全和cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶ－ＳＤＲＮＡ２的５’和３’未端序列,在此基础上,利用ＲＴ－ＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡＤＱ ＢＴＧ Ｐｃ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ＰＣ２Ｆ。     

反义RNA抑制人黑色素瘤细胞表面粘附分子CD44的表达及抑瘤效应

将细胞表面粘附分子ＣＤ４４Ｓ的ｃＤＮＡ反向插入到真核细胞表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ－ＣＡＴ和ＭＭＴＶ－ＬＴＲ启动子下游,构成ＣＤ４４Ｓ的反义ＲＮＡ载体．将其用电击法导入ＣＤ４４＋的人黑色素瘤细胞系ＨＭＭ２３９,转录出的反义ＲＮＡ能不同程度地抑制ＨＭＭ２３９表面ＣＤ４４的表达．ＣＤ４４的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响．将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低     

HCV RNA的检测方法简介

本文讨论了检测丙型肝炎病毒核糖核酸（ＨＣＶＲＮＡ）的样本来源和处理,引物的设计,合成和选择等问题;重点介绍了蛋白酶Ｋ消化法,聚乙二醇沉淀法,异硫氰酸胍一步法,硅凝胶提取法和直接捕获法提取ＨＣＶ　ＲＮＡ的５种方法,以及一步ＰＣＲ法,常规ＲＴ－巢式ＰＣＲ,直接ＲＴ－巢式ＰＣＲ,化学修饰的ＲＴ－巢式ＰＣＲ,联合ＰＣＲ,双温ＰＣＲ和定量竞争性ＰＣＲ等７种ＰＣＲ方法检测ＨＣＶ　ＲＮＡ,用ＰＣＲ检测ＨＣＶ　ＲＮＡ方法的标准化以及检测ＨＣＶＲＮＡ具有非常重要的意义。本文还介绍了一种新型的定量方法－ｂＤＮＡ信号放大技术检测ＨｃＶＲＮＡ。     

电子束辐射对大妻种胚核酸合成活性的损伤效应

电子束辐射损伤大麦种胚核酸合成能力的效应主要表现在使ＤＮＡ复制合成启动推迟,使ＤＮＡ复制、ＲＮＡ合成活性下降,吸涨过程中大麦种胚的ＤＮＡ复动过程。２００与４００Ｇｙ电子束辐射分别使ＤＮＡ复制合成活性的抑制作用强于对ＲＮＡ合成活性的抑制。在５０－５００Ｇｙ范围内,大麦种胚ＤＮＡ复制、ＲＮＡ合成活性均随辐射剂量呈指数下降,其半对数斜率分别为－０．００３９与－０．００１４。根据实验计算,电子束辐射对ＤＮ     

黄瓜花叶病毒山东株(CMV-SD)RNA2全长cDNA克隆的构建及全序列分析

分别利用５’ＲＡＣＥ和３’ＲＡＣＥ确定了ＣＭＶＳＤＲＮＡ２的５’和３’末端序列,在此基础上,利用ＲＴＰＣＲ得到了ＲＮＡ２的５’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２５和３’端一半的ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２３,并通过拼接构建了ＲＮＡ２全长ｃＤＮＡ克隆ｐＣ２Ｆ。通过对ｐＣ２５和ｐＣ２３进行序列测定,得到了ＲＮＡ２的全序列。序列分析结果表明ＣＭＶＳＤＲＮＡ２由３０４８ｎｔ组成,其中存在２个部分重叠的阅读框ＯＲＦ１（７９～２６５２ｎｔ）和ＯＲＦ２（２４１４～２７４６ｎｔ）,分别编码８５８ａａ的２ａ蛋白和１１１ａａ的２ｂ蛋白,并在２ａ蛋白的序列中发现了动植物病毒复制酶所特有的两个保守序列。该株系ＲＮＡ２核苷酸序列与分属ＣＭＶＩ亚组的Ｆｎｙ株系和ＩＩ亚组的Ｑ株系ＲＮＡ２的核苷酸序列同源性分别为９１７％和７５６％;２ａ蛋白的氨基酸序列同源性分别为９３８％和６７７％,２ｂ蛋白的氨基酸序列同源性分别为８３０％和５１３％。同源性比较的结果表明ＳＤ株系属于ＣＭＶＩ亚组。     

多胺对水稻CMS系及其保持系幼穗蛋白质、核酸和活性氧代谢的影响

用ＤＡｒｇ＋ ＭＧＢＧ 处理保持系, 降低花粉可育度, 并使其幼穗中蛋白质、ＤＮＡ 和ＲＮＡ含量以及蛋白酶、ＲＮＡ 酶和ＤＮＡ 酶活性下降,使Ｏ－·２ 生成速率和ＭＤＡ 含量上升。Ｐｕｔ＋ Ｓｐｄ ＋ Ｓｐｍ 可消除或部分消除ＤＡｒｇ ＋ＭＧＢＧ的上述效应（ 对酶活性的影响除外） 。ＤＡｒｇ ＋ ＭＧＢＧ 也使ＰＯＤ、ＳＯＤ 和ＣＡＴ活性上升, 但是,多胺只能降低抑制剂对ＰＯＤ 的刺激作用。用Ｐｕｔ＋ Ｓｐｄ ＋ Ｓｐｍ 处理不育系, 使花粉可育度轻度提高, 并使其幼穗蛋白质、ＤＮＡ和ＲＮＡ 含量略有上升,使蛋白酶、ＤＮＡ酶和ＲＮＡ 酶活性、Ｏ－·２ 生成速率、ＭＤＡ 含量、ＳＯＤ 和ＣＡＴ活性下降, 使ＰＯＤ 活性上升     

多胺对水稻CMS系及其保持系幼穗蛋白质,核酸和活性氧代谢的影响

用Ｄ－Ａｒｇ＋ＭＧＢＧ处理保持系,降低花粉可育度,并使其幼穗中蛋白质、ＤＮＡ和ＲＮＡ含量以及蛋白酶、ＲＮＡ酶和ＤＮＡ酶活性下降,使Ｏ２生成速率和ＭＤＡ含量上升。Ｐｕｔ＋Ｓｐｄ＋Ｓｐｍ有除或部分消除Ｄ－Ａｒｇ＋ＭＧＢＧ的上述效应（对酶活性的除外）。Ｄ－Ａｒｇ＋ＭＧＢＧ也使ＰＯＤ、ＳＯＤ和ＣＡＴ活性上升,但是,用Ｐｏｔ＋Ｓｐｄ＋Ｓｐｍ处理不育系,使花粉可育度轻度提高,并使其幼穗蛋白质、ＤＮＡ和ＲＮＡ含     

一种改进的甲醛—琼脂糖凝胶电泳

构建ｃＤＮＡ文库,进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析以及ＲＴ－ＰＣＲ等分子生物学研究,都需要纯度高、完整性好的ＲＮＡ。鉴定ＲＮＡ的完整性通常需要进行甲醛－琼脂糖凝胶电泳。然而,传统的甲醛－琼脂糖凝胶电泳操作步骤繁杂［１］,本文提出一种改进的甲醛－琼脂糖凝胶电泳,不仅简化了操作,而且效果很好。我们以向日葵总ＲＮＡ和ｃＤＮＡ甲醛－琼脂糖凝胶电泳为例,对这一方法进行介绍。１ 材料与方法１．１ 总ＲＮＡ的提取及ｍＲＮＡ的分离：取向日葵花蕾１ｇ,按照改进的异硫氰酸胍法提取向日葵总ＲＮＡ［２］。利用磁珠法分离ｍＲ－…     

T7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能

根据ａ－鹅膏蕈碱（ａ－ａｍａｎｉｔｉｎ）对真核生物ＲＮＡ聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转 移酶基因（ＣＡＴ）作为报道基因进行体内表达实验,证明Ｔ７噬菌体启动子可为真核生物ＲＮＡ 聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动技术,分别以ＴＡＴＡ框、ＣＡＡＴ 框、ＧＣ框和八核苷酸序列（ｏｃｔａｍｅｒ）为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的Ｔ７启动子可能 与 ＴＦⅡＤ起始转录因子结合,形成 ＤＮＡ－核蛋白质结合物。将 ＴＡＴＡ框和八核苷酸序列分别 接入Ｔ７启动子上游,ＣＡＴ实验显示八核苷酸序列可以增强ＲＮＡ聚合酶Ⅱ对Ｔ７启动子的转录 起始作用。实验结果表明Ｔ７启动子可作为ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的顺式作用因子。     

RNA聚合酶Ⅲ启动子的结构与功能

ＲＮＡ聚合酶Ⅲ (ｐｏｌⅢ )是真核生物催化合成ｔＲＮＡ和 5ＳｒＲＮＡ及一些核小ＲＮＡ和胞质ＲＮＡ必需的酶。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ能够识别ｔＲＮＡ基因中一些高度保守的特征性ＤＮＡ序列而启动下游ＤＮＡ的转录 ,这些序列称为ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子不仅广泛存在于真核细胞中ｔＲＮＡ、Ｕ6核小ＲＮＡ(ＳＮＲ6 )等的基因中 ,也是病毒催化合成一些小片段ＲＮＡ如腺病毒ＶＡＲＮＡ所必需的。ＲＮＡ聚合酶Ⅲ启动子因其能在体内外高效快速地转录某些小片段基因 ,已被人们广泛地应用于核酶和反义ＲＮＡ技术中 ,在众多的ＲＮＡ…     

靶向RNA药物检测和筛选的生物物理学方法

ＲＮＡ和ＤＮＡ不同 ,ＲＮＡ通过折叠成无数种三级结构来完成其在细胞中的不同功能。除了作为ＤＮＡ翻译成蛋白质过程中遗传信息的传递者外 ,ＲＮＡ还可以作为核糖核蛋白 (ＲＮＰ ,ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ)的组成部分 ,并在一些情况下作为ＲＮＰ的催化亚基。在大多数情况下 ,ＲＮＡ是与ＲＮＡ结合蛋白 (ＲＢＰｓ)结合在一起的。天然的或化学合成的物质通过阻断或增强效应蛋白与ＲＮＡ的结合来阻断ＲＮＡ催化功能或是改变ＲＮＡ的结构[1] 。因此我们可以通过研究ＲＮＡ或ＲＮＡ 蛋白质复合物构象的变化来确定天然或化学合成物质…     

香蕉不同组织中总RNA的有效分离

从植物组织中提取总ＲＮＡ是进行植物分子生物学某些方面研究的必要前提。如进行Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交分析,纯化ｍＲＮＡ以用于体外翻译或建立ｃＤＮＡ文库,ＲＴ－ＰＣＲ及差示分析等分子生物学实验,都需要高质量的总ＲＮＡ。因此,从植物组织中提取高质量的总ＲＮＡ是顺利进行上述研究的关键所在。目前常用于植物材料ＲＮＡ提取的方法有脱法［１～４］苯酚法［５,６］和ＣＴＡＢ［７,８］法等。这些方法对于提取某些植物的总ＲＮＡ是有效的,但对另外一些植物来说,却并不一定是好的方法。因为不同植物组织的细胞内外成分复杂多变,在使…     

人端粒酶RNA基因的克隆与鉴定

以人血基因组ＤＮＡ为模板,合成两段２０个寡聚核苷酸为引物,经过ＰＣＲ扩增,得到４８０ｂｐ的片段,克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体中,经电泳、酶切、ＰＣＲ鉴定后测定序列。序列分析表明氙克隆的人端粒酶ＲＮＡ（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅａｓｅ ＲＮＡ,ｈＴＲ）基因含有４８０ｂｐ,包括约４５０ｂｐ的编码模板区主序列和约３０ｂｐ的上游调控区序列,其中模板区的１１个核苷酸（５’－ＣＵＡＡＣＣＣＵＡＡＣ－３’）合成端粒亚     

反义RNA及其在植物学研究中的应用

反义ＲＮＡ最初发现于细菌中,它们是一些较短的、散布的转录产物[1],本身缺乏编码能力,但可以通过碱基配对的方式与靶ＲＮＡ的特定互补区域结合,从而阻抑基因的正常表达,因此,反义ＲＮＡ是高度特异性的基因表达抑制因子。1　自然界中存在的反义ＲＮＡ参与基因表达调控的反义ＲＮＡ是在原核生物中发现的。一些实验结果表明,在质粒的复制、转座子的转座作用及噬菌体的发育进程中,反义ＲＮＡ的调控起着至关重要的作用。ＣｏｌＥ1以及其他相关质粒的复制过程中,ＤＮＡ的延伸起始于一种特殊引物的形成。而这一引物所在的区段,亦可产生与引物本身5…