磷酸钙纳米介导自杀基因载体的构建及其应用研究

构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒(CMV)增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CEAyCDglyTK、PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的HeLa细胞,Lovo细胞在感染以上3种质粒表达栽体后均有yCDglyTK mRNA表达,且对5-FC的敏感性明显增强:HeLa细胞在纳米PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在另外两种复合物感染后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-Fc对其亦无杀伤作用,结果表明靶向性基因治疗栽体能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向治疗肿瘤的目的.     

选择性复制型腺病毒介导的自杀基因HSV -tk 在 肿瘤基因治疗中的应用

自杀基因治疗是肿瘤基因治疗的手段之一,治疗效果与自杀基因能否被高效、选择性的导入肿瘤细胞有关。肿瘤选择性复制型腺病毒（conditionally replication adenovirus,CRADs）可以特异性的在肿瘤细胞中复制,在复制的同时所携带的治疗基因也大量表达。由CRAds介导的自杀基因,实现了对肿瘤的病毒治疗和基因治疗的结合,提高了治疗效率和使用复制型腺病毒的安全性。     

腺病毒载体介导的肝癌细胞专一性自杀基因表达

构建由肝癌细胞专一的ａｆｐ基因表达调节元件控制自杀基因ＨＳＶ－ｔｋ的穿梭质粒,将它与缺陷型腺病毒载体重组,得到ＡｄｒＡＦＰＴＫ病毒。经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等证实它们含ａｆｐ元件和ｔｋ基因。空斑形成试验表明病毒效价达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。同时构建由ＣＭＶ启动子控制ｔｋ基因的类似载体作为对照。将这两个重组腺病毒分别感染ＡＦＰ阳性（ＨｅｐＧ２）或阴性（ＨｅＬａ,ＢＲＬ－３Ａ）细胞株（ｍ．ｏ．ｉ．＝１００）,以丙氧鸟苷（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）处理后,用ＭＴＴ法测定杀伤细胞的效应。结果,ＡｄＣＭＶＴＫ感染这三种细胞后,ＧＣＶ半杀伤浓度分别为１．３、２、＜１μｍｏｌ／Ｌ;但是,ＡｄｒＡＦＰＴＫ感染的ＨｅＬａ和ＢＲＬ－３Ａ细胞的ＧＣＶ半杀伤浓度都＞１０００μｍｏｌ／Ｌ,而对ＨｅｐＧ２细胞只有＜１μｍｏｌ／Ｌ,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒ＡｄｒＡＦＰＴＫ可望用于肝癌的专一性基因治疗     

自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用

自杀基因治疗肿瘤近年来在国内外研究较多并已取得了明显的疗效。目前发现的自杀基因包括：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌GPT基因和DEO基因等。     

重组含HSV-TK基因腺病毒的构建及对肿瘤细胞的杀伤作用

构建含CMV启动子和HSV-TK基因的复制缺陷型重组腺病毒载体(AdCMVTK),用PCR及Southern杂交筛选鉴定阳性空斑,证实AdCMVTK含HSV-TK基因。纯化的Ad-CMVTK滴度达10~(12)pfu/ml。GCV对经Ad-CMVTK感染(M.O.I.=100)的HeLa等3种肿瘤细胞的IC50<4μmol/L,同时观察到明显的旁杀伤效应。AdCMVTK/GCV系统的建立为肿瘤基因治疗的研究提供了新的手段。     

重组含HSV—TK基因腺病毒的构建及对肿瘤细胞的杀伤作用

High-titer replication-defective recombinant adenovirus expressing HSV-TK gene was constructed. Firstly, shuttle plasmid pAdCMVTK containing HSV-TK gene and CMV promoter was constructed and then recombined with right arm of adenovirus DNA. Secondly, the positive plaques containing recombinant adenovirus were identified and selected out by PCR and Southern blotting after infection into human embryo kidney 293 cells. The titer of recombinant adenovirus AdCMVTK was determined by plaque forming assay and it was as high as 10(12) pfu/ml. Tumor cells were infected with AdCMVTK and then treated with GCV. Cytotoxic effects were assayed with MTT method. HeLa, A549 and LoVo cells infected with AdCMVTK (M. O. I. = 100) became sensitive to the prodrug GCV, with IC50 less than 4 mumol/L. Significant bystander effect was observed. Results here show that the AdCMVTK/GCV system might be potential in the gene therapy for cancer.     

腺病毒载体研究进展

腺病毒载体目前广泛地应用于基因治疗,随着对腺病毒分子结构与功能及感染机制的深入了解,人们在降低其免疫原性,增强基因导入特异性,增强感染和表达效率等方面进行了许多探索,本文就这方面的研究进展进行综述。     

携带p53基因的重组腺病毒的构建及对肿瘤细胞抑制的研究

１　材料与方法１１　质粒ｐＣＭＶｐ５３ＢＡＭ由美国约翰·霍普金斯肿瘤中心ＢｅｒｔＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ教授赠送［５］;ｐＲＳｅｔＡ购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司;ｐＣＡ１３和ｐＢＨＧ１１为ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍＩｎｃ．产品。ｐＢＨＧ１１包含腺病毒Ａｄ５基因组３６ｋｂ中的约３４ｋｂ序列,但Ａｄ５Ｅ１区１８８ｂｐ至１３３９ｂｐ缺失,代之以氨苄青霉素抗性基因和复制起始位点。ｐＢＨＧ１１缺少包装信号φ（２２ｂｐ至３４２ｂｐ）和Ａｄ５Ｅ３区（２７８６５ｂｐ至３０９９５ｂｐ序列）。ｐＣＡ１３…     

腺病毒载体及其在基因治疗研究中的应用

腺病毒载体在基因治疗研究中初露锋芒,引起关注,文章就腺病毒基因组的基本结构、腺病毒载体的类型及构建、重组腺病毒在基因治疗研究中的应用及其主要优、缺点等方面进行了较为全面的综述．     

腺病毒载体介导CEA基因元件调控自杀基因治疗

构建以CEA启动子控制HSV-TK基因表达的复制缺陷型腺病毒载体(AdCEATK).纯化的重组腺病毒滴度达1×10¹²pfu/ml.CEA阴性的HeLa细胞感染AdCMVTK后对丙氧鸟苷(GCV)很敏感,而感染了AdCEATK后不被GCV杀伤.与此相反CEA阳性的LoVo细胞中AdCMVTK和AdCEATK都有很好的表达活性,说明CEA启动子有良好的细胞专一性.AdCEATK/GCV系统还有明显的旁杀伤效应.此载体将有助于实现对CEA阳性肿瘤的专一性自杀基因治疗.     

腺病毒及腺病毒相关病毒载体与基因治疗

腺病毒及腺病毒相关病毒能感染增殖与静止的细胞,宿主范围广,其稳定,安全滴度高,转染效率高,腺病毒载体能承载较大的外源基因,腺病毒相关病毒载体能定向整合入靶细胞基因组内等特点,使腺病毒及腺病毒相关病毒载体成为体内用于基因治疗的理想运载系统。     

一种辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建及其在小鼠体内 …

腺病毒载体具有在离体细胞和动物体内高效转移和表达外源基因的优点,但由于第一代腺病毒载体能在靶细胞内表达病毒结构蛋白,并诱导机体的细胞和体液免疫反应,影响了大体内的稳定表达。为了克服这一缺点,构建了一种辅助病毒依赖型腺病毒载体ＨＡｄＩ－ｈＦＶＩＩＩ。该载体去除了病毒基因组的ｌ３、Ｌ１、Ｌ２、ＶＡＩＶＡＩＩ、ｐＴＰ等基因序列。在第一代重组病毒ＡｄＩ－ｈＦＶＩＩＩ辅助下,能在２９３细胞包装和扩增。经氯化     

腺病毒载体在基因治疗和疫苗研究中的应用

自从二十世纪五十年代开始认识腺病毒（Adenovirus）以来,对腺病毒的生物学和免疫学特征已经有比较多的认识。腺病毒科包括禽腺病毒属（Aviadenovius）和哺乳动物腺病毒（Mastadenov irus）两个属。除人腺病毒以外,一些哺乳动物的腺病毒和禽腺病毒也成为基因治疗和载体疫苗研究的热点,如猪腺病毒3型（PAV-3）、牛腺病毒3型（BAV-3）、绵羊腺病毒（Ovine adenovirus,OAV）、禽腺病毒（Aviadenovirus）、犬腺病毒（Canine adeno virus,CAV）和黑猩猩腺病毒（Chimpanzee adenovirus）。不同种属的腺病毒虽然基因组序列完全不同,但其结构和功能却非常相似,而且各型腺病毒之间很少有交叉免疫反应,这就为利用这些腺病毒研制基因治疗载体和活载体疫苗提供了丰富的材料。近年来的研究也发现,如果利用一种腺病毒载体来进行重复免疫,宿主针对腺病毒载体蛋白的免疫反应比较强大,造成转基因表达时间缩短,重复免疫的效果较差,换用不同的病毒载体,则可以回避这种免疫反应,提高转基因的表达时间和保护性免疫反应。腺病毒可以感染很多分裂期或静止期细胞,即使在一些高度分化的组织细胞中也可增殖,如可有效的感染肌肉组织、心、肺和脑组织,并能高效的复制、表达其基因产物,因此腺病毒成为基因治疗和活病毒载体疫苗研究的首选工具。     

腺病毒载体及其基因治疗制品的质量控制

本文介绍了腺病毒与其载体作用相关的基本知识,腺病毒载体的构建方法,从正反两个方面对腺病毒进行评价,综合了腺病毒载体在基因治疗的应用,并对以重组腺病毒为载体的基因治疗制品应考虑的质量问题概括     

腺病毒载体的应用及进展

腺病毒载体是近年来继逆转录病毒载体之后被广泛应用的一个基因运载系统。它具有宿主细胞广泛、繁殖滴度高、不整合及相对安全等特点,在基因治疗中发挥越来越大的作用。本介绍了Ｅ１区缺失为特征的第一代腺病毒载体应用的有效性、安全性等方面的研究情况,和旨在克服第一代腺病毒载体不足的第二代载体构建方面的进展。     

动物腺病毒用作基因治疗载体的研究进展

动物腺病毒具有与人腺病毒类似的基因组结构,近年来,通过缺失部分病毒基因并建立相应的互补细胞系,已构建成功大,绵羊及牛腺病毒栽体,这些新型动物腺病毒载体即可将外源基因转移到人体细胞内表达,本身又不能在其中复制繁殖,具有较高的安全性,人体内地们的免疫应答,因此可望替代人腺痍和为基因治疗及基因免疫的载体。     

CD/TK单、双自杀基因重组腺病毒的制备及初步应用

为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺病毒穿梭载体 ,细菌内同源重组法获得重组腺病毒质粒 .脂质体介导下转染 2 93细胞进行包装并大量扩增得到Ad TK、Ad CD、Ad TK CD、Ad LacZ 4种重组腺病毒 .氯化铯 (CsCl)梯度离心法纯化后利用报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)测定病毒滴度 ,可达 10 9pfu ml .PCR和Western印迹法对外源基因进行鉴定 ,证明单、双自杀基因均已整合入腺病毒基因组并表达 .重组腺病毒感染血管平滑肌细胞后 ,用MTT法比较了单、双自杀基因的杀伤作用 ,发现在感染复数≤ 2 0时 ,双自杀基因对细胞的抑制作用明显高于单基因 .成功地构建腺病毒双自杀基因共表达载体 ,为进一步的体内外实验奠定了基础 .     

肿瘤细胞对腺病毒载体转染的敏感性研究

带有基因LacZ的5型缺陷性腺病毒感染肿瘤细胞,X－gal染色,检测腺病毒对肿瘤细胞的转染率。结果显示,随着病毒感染复数量（multiplicityofinfection,m.o．i）的增加,转染率也增高,且无细胞毒作用。各种肿瘤达到100％转染所需病毒量是不同的,人类肿瘤细胞系100％转染所需的m.o．i分别是：Hela细胞为100,GRC肾癌细胞为200,Hep-2喉癌细胞为200,鼠肿瘤所需病毒量较大,Lewis肺癌细胞为500,BST膀胱癌细胞为600。说明不同肿瘤细胞对腺病毒载体转染的敏感性是不同的。