抗人活化血小板单抗SZ—51嵌合抗体的构建及表达

ＳＺ－５１是一种抗人活化血小板单克隆抗体,并显示了很好的导向血栓显像与导向溶栓了减少该单抗的免疫原性以及能获得高效表达的ＤＺ－５１“人源化”单抗,我们构建了真核表达载体α－Ｌｙｓ１７－５１ＶＫ／Ｈｕ,α－Ｌｙｓ３０－５１ＶＨ／Ｈｕ。应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ分别将重,轻链表达载体导入骨髓瘤细胞ＳＰ２／０中,并在相应的选择性培养基中进行耐药克隆筛选,经过体外长期培养和二次单克隆化,获得了一株高效表达重     

抗人活化血小板单抗SZ一51嵌合抗体的构建及表达

ＳＺ－５１是一种抗人活化血小板单克隆抗体,并显示了很好的导向血栓显像与导向溶栓性能。为了减少该单抗的免疫原性以及能获得高效表达的ＳＺ－５１“人源化”单抗,我们构建了真核表达载体ａ－Ｌｙｓ１７－５１ＶＫ／Ｈｕ．ａ－Ｌｙｓ３０－５１ＶＨ／Ｈｕ。应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法分别将重、轻链表达载体导入骨髓瘤细胞ＳＰ２／０中,并在相应的选择性培养基中进行耐药克隆筛选,经过体外长期传代培养和二次单克隆化,获得了一株高效表达重组ＳＺ－５１嵌合抗体的细胞株。培养上清中抗体蛋白的表达量为５ｍｇ／Ｌ,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实重组嵌合抗体具有与亲本鼠源单抗相同的ＧＭＰ－１４０结合特性,而且能与鼠源ＳＺ－５１单抗竞争结合活化血小板。本研究结果表明,基因工程“人源化”ＳＺ－５１单抗可以作为导向载体进行导向显像与导向溶栓,并为今后进一步应用于临床展示了良好的前景。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ⅰ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列,与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架,构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ,其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞,ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒,这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１ｔｓＫ的混合毒株ｄｖＨＳＬ。将此混合毒株感染传代细胞和神经细胞,可在其中表达ＬａｃＺ基因,而在生理温度（３７℃）下,混合毒株的复制受到抑制。提示这种缺陷型疱疹病毒载体有用于向神经系统基因转移的可能性。     

PARP酶抑制剂未引起整合的外源LacZ基因的丢失

使用聚ＡＤＰ核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）ＮＡＤ位点抑制剂苯甲酰胺（ＢＡ）研究了降低ＰＡＲＰ酶活性对外源ＬａｃＺ基因整合稳定性的影响,利用ＤＮＡ体外重组技术将ＬａｃＺ基因全序列插入到真核表达载体载体ＰＳＶ２ｎｅｏ的ＨｉｎｄⅢ位点,构建了一个具有真核细胞ｎｅｏ基因筛选标记和ＬａｃＺ基因的真核表达重组体ＰＳＶ２ｎｅｏ－ｂｅｔａ－ｇａｌ将该重组体导入ＨｅＬａ细胞,经Ｇ４１８筛选获得了能稳定表达β－半乳糖苷酶的Ｈ     

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶ ｔｓＫ株辅助下进行复制和包装,并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ,以及它的应用。该质料中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而,该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来,继而装入目的基因。本研究在此基础上,新构建了一     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达

应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）人－鼠嵌合抗体重,轻链基因,鼠源单克隆抗体ＯＨ３重,轻链可变区（ＶＨ,ＶＬ）ｃＤＮＡ分别与人免疫球蛋白恒区γ３,ｋ,ｃＤＮＡ拼接成人－鼠嵌合抗体基因,含嵌合抗体的转移载体与线性化病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,并通过点杂交ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析获得重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和竞争ＥＬＩＳＡ表明以重组病毒感染的     

单纯疱疹病毒I型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ｉ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列,与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架,构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ,其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞,ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒,这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１     

HCV核心蛋白免疫优势肽AA32—45抗原化抗体的构建

经定点突变,在抗ＨＢｓＡｇ单克隆抗体重链Ｖ区产生一个ＸｈｏＩ位点并插入编码ＨＣＶ核心蛋白免疫优势肽ＡＡ３２￣４５的互补寡核苷酸片段,构成抗原化ＶＨ基因。抗原化ＶＨ与人γ３恒区ｃＤＮＡ拼接成嵌合重链基因并与嵌合轻链基因共同构建成杆状病毒表达系统转移载体,经共转染筛选到重组病毒ＢａｃＨＬ－Ｅ１和ＢａｃＨＬ－Ｅ２,感染Ｓｆ９细胞分别表达Ｉｇ－Ｅ１和Ｉｇ－Ｅ２。Ｉｇ－Ｅ１与正常免疫球蛋白分子一样能形成四聚     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素（ｐＧＨ）基因的ｃＤＮＡ进行测序,得到ｐＧＨｃＤＮＡ的全序列,并与Ｓｅｅｂｕｒｇ等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白ＸＩＶ启动子的转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４构建出含ｐＧＨ基因的重组质粒ｐＸ３／４－ｐＧＨ。将ｐＸ３／４－ｐＧＨ与致死缺失型线性化ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ＾－ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,构建出既能形成多角体又能表达ｐＧＨ基因的苜蓿丫纹夜蛾     

半合成抗体库的构建及抗Tie2 Fab抗体的筛选

构建一个半合成抗体库 ,不经免疫制备人源抗Tie2Fab抗体。通过RT PCR方法 ,从人脐带血淋巴细胞总RNA扩增轻链基因及重链VH段基因 ,将轻链基因插入pCOMb3载体中 ,得人轻链质粒库 ;从HBsAb的Fd段基因制备含有不同长度随机化CDR3的FR3 CDR3 J CH1片段 ,然后将VH段基因与随机化的CDR3融合 ,得到Fd基因片段 ,再将其插入轻链质粒库中 ,得半合成人Fab质粒库。通过多次建库 ,获得总容量为 2× 1 0 7的半合成抗体库。其Fd段和轻链基因的重组率为 5 0 %。经 3轮淘洗 ,从噬菌体抗体库中筛选到与Tie2抗原特异结合的噬菌体克隆。测序确定抗体基因序列     

OGT 多克隆抗体的制备及特异性分析

目的:为了探讨O-GlcNAc糖基转移酶OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体。方法:在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(464-949位点氨基酸)做抗原。首先,构建OGT的C末端催化结构域(464-949位点氨基酸)的重组表达载体pET30-a-OGT-C,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白。再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性。结果:多抗效价达1:80000;在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。结论:实验结果表明,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。     

抗CPV-2a单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

犬细小病毒病是危害养犬业的重要传染病之一,患病犬难以治愈.单克隆抗体治疗此病效果明显,本文介绍了制备抗CPV-2a单克隆抗体的方法.用纯化的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 2a型分离株免疫新西兰大白兔和Balb/c小鼠制备抗CPV-2a多克隆抗体及单克隆抗体.经亚克隆得到1H9、2B5、2B7和2C7共4株单抗,Western blotting鉴定单抗的免疫反应性;间接ELISA方法检测单抗的特异性.为了快速对犬细小病毒病作出诊断,建立了CPV-2a双抗夹心ELISA方法.兔多抗作为捕获抗体,鼠单抗作为示踪抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG作为检测系统;捕获抗体和示踪抗体最佳稀释度分别为1:800和1:2 000;检测系统最佳稀释度为1:4 000.结果表明:所得4株单抗与pET-32a-VP2蛋白发生特异性反应,且与狂犬病毒(RV)、犬温热病毒(CDV)不交叉反应;建立的双抗夹心ELISA方法对病毒的最低检出量为4.375 μg/mL,与美国RB试剂盒相比,符合率为95%.单抗制备为犬细小病毒病的治疗奠定了基础;双抗夹心ELISA方法的建立为疑似粪便样本提供了简单、快速和可靠的检测手段.     

Development and Characterization of a Monoclonal Antibody to Phytosiderophores

Mugineic acid-family phytosiderophores (MAs) are low molecularweight chelators that are secreted by graminaceous plants, formcomplexes with soil Fe(III) and are essential for plant growth.Methods to detect MAs which include HPLC and radio-immunoassaywith polyclonal antibody require sophisticated equipment orradio-labelled MAs which are difficult to synthesize. Our objectivewas to develop a detection and quantitation system for MAs basedon monoclonal antibody specificity and technology. A monoclonalantibody was produced which reacts with nicotianamine (NA),deoxymugineic acid (DMA), mugineic acid (MA) and epi-hydroxymugineicacid (epi-HMA) in a competitive ELISA. Azetidine-2-carboxylicacid (A-2-C) was not reactive while N-(3-amino-3-carboxypropyl)azetidine-2-carboxylic acid (A-2-C dimer) was partially reactive.The range of detection using the competitive ELISA is from 2x 10^–6 to 2 x 10^–7 M MAs. Besides detection andquantification of MAs, the potential uses for the monoclonalantibody are numerous and include affinity chromatography andimmunocytochemistry. (Received September 26, 1991; Accepted December 16, 1991)     

双专－性抗体介导的纤溶作用

用双功能团试剂将抗尿激酶单克隆抗体Ｎ３４的ＩｇＧ和抗人活化血小板α－颗粒膜蛋白ＧＭＰ－１４０单克隆抗体ＳＺ－５１的Ｆａｂ片段通过二硫键共价偶联,偶联的抗体保留了对各自抗原的亲和性。这种对尿激酶和血栓同时具有亲和活性的双专一性抗体（Ｎ３４－ＳＺ－５１）提高低分子量尿激酶的溶栓效率３８倍,且对血浆中纤维蛋白原的含量基本上不影响。     

Cloning and Expression of a Novel Murine Anti-human Fas Antibody

Agonistic anti-human Fas antibodies that can induce apoptosis are thought to have therapeutic effects for various diseases resulting from an abnormality of the Fas/FasL system. However, some anti-Fas antibodies show toxicity, and it is difficult to investigate their therapeutic and toxicological effect using animals because of their species specificity. We previously obtained a murine anti-human Fas mAb, HFE7A. HFE7A reacted with both human and murine Fas, and mitigated lymphadenopathy without any sign of hepatotoxicity in MRLgld/gld mice. It is suggested that humanized HFE7A would be a therapeutic treatment for various diseases resulting from an abnormality of the Fas/FasL system. Here we isolated the cDNAs that code for the heavy and light chains of HFE7A and identified the corresponding nucleotide sequences. The recombinant HFE7A was indistinguishable in binding and apoptosis-inducing activity to that from a hybridoma cell line. These data provide essential information for the humanization and clinical application of the humanized HFE7A.     

用于抗体/抗体片段表达的系统及其高表达策略

随着诊断及治疗领域内单克隆抗体及片段的广泛应用,传统的杂交瘤生产技术已很难满足对其日益增长的需求。由于基因重组技术及生物工程技术的迅速发展及日益成熟,大规模生产单克隆抗体/片段已成为可能。对目前常用的载体及表达系统进行列举和比对,这些系统包括大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。在第二部分,对提高表达产率的策略进行了探讨,其中包括:表达蛋白质本身的修饰(如蛋白融合、定点突变)、表达系统的选择、密码子优化、表达环境的优化和抗体体内表达等。最后,对抗体/抗体片段高表达的前景作了展望,认为生物信息学将在此领域发挥重大作用,并且相信建立高表达平台的时机已经来到。     

Characterization of a Monoclonal Antibody and a cDNA for Polyubiquitin of Amoeba proteus

A monoclonal antibody was obtained that reacts with many different proteins (14-200 kDa) of Amoeba proteus. By indirect immunofluorescence microscopy we found the antigens to be dispersed throughout the cytoplasm but were more concentrated in the nucleus. The antibody cross-reacted with proteins of Tetrahymena, Xenopus embryo, and mouse macrophages. Using the antibody as a probe we cloned a cDNA of 1.2 kb coding for ubiquitin in five repeats. Amino acid sequences of ameba's polyubiquitin showed the most variations among the nineteen polyubiquitins of other organisms compared. The well-conserved ²⁰Ser and ⁵⁵Thr residues were replaced with Gly and Ser. respectively. The ²⁸Ala residue found in most organisms was replaced with Gln or Glu in the amoeba. Amoebae contained two ubiquitin-mRNAs that could be detected by Northern blot analysis using the cDNA as a probe. In an analysis for specificity, the antibody reacted with polyubiquitin and ubiquitin-fusion proteins larger than 14 kDa but not with monomeric ubiquitin. The antibody is a useful probe in the detection and characterization of proteins ubiquitinated in response to cellular stresses.     

Antibody diversity: a link between switching and hypermutation

Recent work indicates that mutations in a cytidine deaminase homologue ablate both immunoglobulin class switch recombination and somatic hypermutation. These findings now explain cases of autosomal hyper-IgM syndrome and reveal that critical components for key functions of B cells require RNA editing.