人NMT的表达,纯化和活性研究

利用ＰＣＲ技术并进行ＤＮＡ序列测定,从人脑ｃＤＮＡ库中扩增得到人豆蔻酰ＣｏＡ蛋白Ｎ端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在Ｔ７启动子控制下的成熟型和Ｈｉｓ６融合型的表达质粒ｐＭＦ－ｈＮＭＴ３和ｐＭＦＨＴ－ｈＮＭＴ２。转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果显示,在３７℃条件下表达的各种重组ｈＮＭＲ几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的Ｈｉｓ６－ｈＮＭＲ绝大     

Epstein—Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

hBMP—2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高,细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃ     

小鼠金属硫蛋白 Ⅰ cDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ｐＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ｐＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确．再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ／Ｌ     

小鼠金属硫蛋白ⅠcDNA编码序列的克隆及其在昆虫细胞中的表达

将质粒ＰＢＸ－ＭＴ上的小鼠ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ片段切下作为模板,通过ＰＣＲ方法删除该片段的非编码序列,将编码序列克隆到质粒ＰＢＳ－ＳＫ中,经ＤＮＡ序列测定后证明其克隆序列正确,再将ＭＴ－ⅠｃＤＮＡ编码序列插入到转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点之间,通过磷酸钙／ＤＮＡ共转染方法将其导入昆虫细胞Ｓｆ９中,以Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＤｏｔＥＩＡ方法对表达产物进行了检测,表达量为１ｍｇ＝     

Epstein-Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白联合免疫效果相似。不同启动子控制下的ＭＡ基因,诱发小鼠免疫应答无明显差异。     

重组I型cAMP依赖的蛋白激酶调节亚基的表达,纯化和鉴定

Ｉ型蛋白激酶的调节亚基（ＲＩ）具有两个ｃＡＭＰ结合位点,对ｃＡＭＰ具有很高亲和力和特异性,我们从人神经细胞中克隆人ＲＩ亚基ｃＤＮＡ片段（编码氨基酸残基９３－３８１）并将其亚克隆至ｐＥＴ３０ａ原核表达载体,实验表明该表达质粒在大肠杆菌ＢＬ２１中,在ＩＰＴＧ诱导下,表达产生大量带聚组氨酸标记的重组ＲＩ亚基。这些蛋白质以可溶性蛋白形式存在,经组氨酸结合金属螯合树脂亲和柱层析纯化后,每０．１升培养菌可制备     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

柯萨奇B3病毒结构和非结构蛋白基因重组质粒的构建及其在体外真核细胞中的

制备ＣＶＢ３结构蛋白和非结构蛋白重组质粒ＤＮＡ疫苗时,采用ＲＴ－ＰＣＲ从ＣＶＢ感染的ＨｅＬａ细胞中扩增ＶＰ１、ＶＰ２、２Ａ和３Ｄ基因,重组入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３中,构建ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ２、ｐｃＤＮＡ３／ＶＰ１、ｐｃＤＮＡ３／２Ａ和ｐｃＤＮＡ３／３Ｄ重组质粒,经酶切和测下实扩增的序列并将各重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７,用ＲＴ－ＰＣＲ检测ｍＲＮＡ的转录,用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物。结果４种重组质粒酶切出相应大小的目的片段,经测序证实为ＣＶＢ３相应序列,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实能够在体外真核细胞中表达。本文成功构建ＣＶＢ３结构与非结构蛋白的重组质粒ＤＮＡ疫苗,为进一步研究其免疫效果奠定了基础。     

人重组PSP及其生物活性研究

为了获得人重组 persephin( PSP)并研究其生物学活性 ,从人胎脑组织中提取总 RNA,以RT- PCR方法获取编码人 PSP成熟蛋白 c DNA.将人 PSP c DNA插入含 T7启动子的质粒 p ET-2 8a( + ) ,构建表达质粒 p ET- PSP,转化大肠杆菌 BL 2 1 ( DE3)获得表达菌株 BLPSP,经 IPTG诱导表达的 PSP形成包含体 .凝胶自动扫描分析表明 ,PSP表达量约占菌体总蛋白 2 0 %以上 .用Ni2 + - NTA树脂一步法纯化目的蛋白 ,纯度达 85%以上 .纯化和复性的 PSP蛋白能显著促进脊髓神经元的存活 .     

人内皮生长抑制素基因克隆表达及其抑瘤作用

内皮生长抑制素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ是最近报道具有抑制肿瘤生长和铁蛋白质,为此,从正常人肝细胞株Ｌ０２中抽提总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获得了人内皮生长抑制素编码序列,序列分析表明,内皮生长抑制素ＣＤＮＡ开放阅读框架全长５５５ｂｐ,此基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为Ａ地８４０６０）,共编码１、８４个氨基酸残序列为５个碱基与文献报道不同,蛋白质序列中有３个氨基酸残基与文献报道不同,说明存在人种间差异。将人     

人铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆和乳酸乳球菌中的表达

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肝总ＲＮＡ中分离扩增了０．４５ｋｂ的人铜锌超氧化物歧化酶（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）基因的ｃＤＮＡ序列,首先克隆至大肠杆菌表达质粒ｐＥＴ２３ｂ,进行了序列测定和超高表达,将Ｃｕ／Ｚｎ,ＳＯＤｃＤＮＡ亚克隆至乳酸乳球菌表达载体ｐＭＧ３６ｅ,用电穿孔法将重组质粒ｐＭＧ３６ｅｓｏｄ转化到乳酸乳球菌,获得Ｃｕ／Ｚｎ ＳＯＤ的组成型表达,其表达量约占乳酸乳球菌可溶性蛋白的５％以上,活性染色表     

人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达

将编码人组织激肽释放酶成熟蛋白的基因片段扩增并分别克隆到原核表达载体pET2 8(b)及分泌型表达载体pET2 0 (b)中 ,使其C端融合 6×HisTag序列 .转化不同受体菌 ,IPTG诱导表达后利用SDS PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析 .在 6株基因工程菌株中 ,均表达出分子量约30kD的激肽释放酶融合蛋白 ,其中激肽释放酶在pET2 8载体中的表达水平高于pET2 0载体 .pET2 8和pET2 0载体表达的重组激肽释放酶蛋白分别占菌体总蛋白约 2 6 %和 10 % .Western印迹分析表明 ,目的蛋白可与抗人血清KK单克隆抗体发生特异性反应 .未经纯化的激肽释放酶融合蛋白具有一定的水解苯甲酰精胺酸乙酯 (BAEE)的能力 .在大肠杆菌中获得了人组织激肽释放酶的高效表达 ,表达产物具有免疫原性和生物活力 ,这为研究其生物功能和开发基因工程药物奠定基础     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆,测序及表达

用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）,以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,扩增了人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ,ＺｎＳＯＤ）的ｃＤＮＡ,并进行序列分析,将该ｈＣｕ,ＺｎＳＯＤｃＤＮＡ重组到Ｔ７启动子控制下的分泌型表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＳＯＤ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。ＳＤＳＰＡＧＥ及蛋白质印迹分析表明,经１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代βＤ半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后,可高效表达一分子量为１９ｋＤ的蛋白质,与抗人ＳＯＤ多抗有特异的免疫反应,表达量约为菌体总蛋白质的３０％,具有特异性ＳＯＤ酶活性,酶活力可达１７９７ｕ／ｍｌ培基。     

缩短的人巨噬细胞集落刺激因子（M－CSF）在大肠杆菌中的表达

本文用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子（编码３～１４９氨基酸）ｃＤＮＡ基因,并克隆在质粒ｐＥＴ３ｄ中,在Ｔ７启动子指导下,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥ中获得了和一个６组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合ｍ－ＣＳＦ表达量占菌体总蛋白的１２％,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螫合亲和层析一步纯化,所得的融合（Ｈｉｓ）６－Ｍ－ＣＳＦ在还原型ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上基本呈一条均一的蛋白质条带。     

次组淋巴趋势化因子SLC的克隆及其在原核系统中的表达

以中国人的淋巴细胞组织为材料提总RNA,用RT－PCR的方法扩增了次级淋巴组织趋化因子（Secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC)的成熟肽基因,序列分析表明,我们克隆的SLC基因与文献报道的仅有一个核苷酸的差异,且并不影响氨基酸的编码。将PLC的cDNA插入含T7启动子的表达载体pET-28a( ）中构建重组质粒pET-SLC,转化大肠杆菌BL21（DE3）筛选表达菌株,表达菌株经1mmol/LIPTG诱导表达3－5h后,超 声破菌,离心后将上清进行SDS－PAGE,可以看到在18KD左右处有明显的表达条带,用Ni^2 亲和层析柱纯化表达物,纯度表达90％以上。     

人TIMP-1 cDNA克隆、真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

根据 Gen Bank中 TIMP- 1基因的碱基序列 ,用 RT- PCR方法从人的正常肾组织中克隆出包含信号肽在内的 TIMP- 1全长 c DNA序列 .采用 T- A克隆的方法将之插入 p CRR2 .1中间载体 ,DNA测序证实该片段序列与文献报告的完全一致 .利用亚克隆的方法将 TIMP- 1 c DNA片段克隆到 pc DNA3载体上 ,构建出 pc DNA3/ TIMP- 1的真核表达载体 ,通过脂质体 DOTAP转染至 COS-7细胞 ,Northern印迹及原位杂交证实在 COS- 7细胞上获得人 TIMP- 1的高效表达 ,细胞增殖实验表明 TIMP- 1的高产表达可促进 COS- 7细胞的增殖 ,证实了所转染人 TIMP- 1的生物活性     

Candida cloacae长链脂肪酸醇氧化酶基因的克隆与表达

Ｃａｎｄｉｄａｃｌｏａｃａｅ是利用链烃和长链脂肪酸作为碳源来生长的一种工业酵母 .长链脂肪酸在单加氧酶作用下 ,使远离羧基的甲基羟化 ,生成ω 羟脂肪酸 .后者在生物体中通过两条连续的氧化通路进行氧化 (ω氧化通路和 β氧化通路 ) .醇氧化酶是ω氧化通路中的重要组成酶 ,它可以催化链烃或长链脂肪酸分子中的羟基氧化为醛基 ,后者再经其它酶氧化为羧基 .长链脂肪酸通过ω氧化通路生成二羧基化合物 ,它可作为重要的化工原料 ,广泛应用于香料、多聚酰胺、多聚酯、胶类和环内酯抗生素的生成[1] .ω氧化通路中产生的羧基化合物再经 β 氧…