白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶三维结构分子模型研究

基于四种原核细胞色素Ｐ４５０晶体蛋白Ｐ４５０ＢＭ３、Ｐ４５０ｃａｍ、Ｐ４５０ｔｅｒｐ、Ｐ４５０ｅｒｙＦ模建白色念珠菌羊毛甾醇１４α－去甲基化酶三维结构。序列匹配采用四种晶体结构比较结果基础之上提出的细胞色素Ｐ４５０超家族蛋白基于结构知识的序列匹配方法。以Ｐ４５０ＢＭ３晶体结构坐标模建目标蛋白结构保守区主链结构,结构保守区侧链构象来源于四种晶体蛋白与模建蛋白对应残基同源性得分最高残基构象。模建结果用分子力学和分子动力学进行结构优化,模建结果蛋白采用Ｐｒｏｆｉｌｅ－３Ｄ图、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ图和疏水图分析确证结构的合理性。并根据模型推测与血红素辅基相互作用的残基、与氧化还原偶联蛋白作用和参与电子传递的残基、底物进出通道和活性位点的残基。这些研究结果为定点突变研究、抗多肽抗体结合实验等提供理论依据,为高效低毒抗真菌药物合理设计提供靶标。     

细胞色素P450超家族蛋白质基于结构知识的序列联配

应用计算机程序对细胞色素Ｐ４５０蛋白２０个家族的代表序列进行初步多序列联配后,利用结构知识对匹配结果加以调整,调整的依据是Ｐ４５０蛋白二级结构特征和某些超二级结构特征的保守性,三维结构空间配置的保守性,在结构与功能重要残基的保守性,亲水和疏水片段的保守性。大量定点突变实验、选择性化学修饰实验、抗多肽抗体结合实验等能很好地确证该联配结果的正确性。联配结果对真核Ｐ４５０蛋白膜结合方式、活性位点残基分布、与氧化还原偶联蛋白有相互作用的残基的分布等作出了合理的推断。细胞色素Ｐ４５０超家族蛋白基于结构知识的序列联配的尝试对Ｐ４５０蛋白结构与功能关系研究提供了参考     

细胞色素P450超家族4种蛋白质晶体结构比较研究

通过二级结构特征比较、三维结构比较和疏水图分析阐明了４种Ｐ４５０晶体结构的保守性。尽管４种晶体蛋白的氨基酸序列等同率只有１９％￣２６％,但是它们都有相同的１３个α螺旋和β１￣β４四个片层结构。以Ｐ４５０血红素辅基中卟啉环碳原子作为叠合点叠合４种晶体结构,由叠合结构推导出４种蛋白质基于结构的序列联配。通过计算晶体结构各二线结构Ｃα原子之间均方根偏差,分类类聚分析法分析,发现Ｐ４５０蛋白三维结构可分为     

人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用

从人新鲜的胎盘组织中提取总ＲＮＡ,以ＲＴ－ＰＣＲ法获取了人组织金属蛋白酶抑制－３成熟蛋白的ｃＤＮＡ。序列分析表明,ＴＩＭＰ－３成熟蛋白含有１８８个氨基酸残基,其中１２个半胱氨酸残基在ＴＩＭＰ家族中高度保守。将人ＴＩＭＰ－３ｃＤＮＡ插入含７启动子的质粒ｐＥＴ－２４构建表达质粒ｐＥＴ－ＴＩＭＰ３,转化大肠杆菌ＢＬ２１,筛选表达菌株ＢＬＴＩＭＰ３。     

肺炎链球菌双组份系统中的组氨酸激酶(YycG)的同源模建与分析

对肺炎链球菌双组份系统中的组氨酸激酶YycG进行同源模建, 并分析其与底物ADP的相互作用, 为寻找特异性的激酶抑制剂提供了理论依据。采用同源模建的方法构建YycG蛋白的三维结构, 并用ProCheck、Profile_3D软件对此结构模型的合理性进行验证; 用Autodock4.0软件将结构模型与ADP进行自动对接, 分析二者之间的相互作用。序列比对结果显示肺炎链球菌YycG蛋白与Thermotoga maritima X-ray晶体结构序列的同一性达33%; YycG模建后的结构与模板能很好的叠合; 在活性口袋处的保守的氨基酸残基Asn145、Asn149、Lys152以及口袋内部的疏水残基在结合、水解底物ADP的过程中发挥重要作用。组氨酸激酶YycG的模建合理, 该结构模型可作为设计抗菌药的研究起点。     

人白介素15及突变体的分子设计

以人白介素－２晶体结构为模板同源模型建人白介素１５及其两株突变体（Ｎ端缺失４个氨基酸、Ｃ端缺失３个氨基酸）的空间构象。在ＣＶＦＦ力场下,经过分子力学优化、常温分子动力学模拟获得稳定立体结构模型。借助空间构象残基的亲疏水性分析,利用Ｄｅｌｐｈｉ一性分析蛋白表达静电分布,进行从理论上预测人白介素１５及两株突变体生物学功能的性、差异性。结合分子生物实验,在ＰＢＶ２２０载体中克隆表达获得人白介素１５及两载     

鼠源单克隆抗体HAb25可变区的CDR-移植法人源化计算机辅助设计

目前鼠源抗体人源化是克服其免疫原性的主要手段。在结构模建基础上的计算机分析为抗体人源化设计提供了必不可少的辅助。本设计首先对肝细胞癌特异性抗体HAb25可变区进行了同源模建,然后分析决定CDR初始构象的可能残基,包括正则结构关键残基、CDR可接触残基、界面残基、包埋残基,以及与免疫识别密切相关的表面残基,综合考虑并结合多重序列比较,参照人源化模板,提出了人源化替代的方案。     

苏云金芽孢杆菌Ⅳ型抗癌晶体蛋白的分子模建

通过同源建模得到了抗癌晶体蛋白Parasporin-4的初始三维结构,利用分子动力学的方法对初始三维结构进行优化,同时分析了模建分子的结构,最后利用Ramachandran plot,结构匹配等方法对模型进行评价。结果显示得到的Parasporin-4结构是具有三个结构域,蛋白模型分子中的键长、键角以及二面角的分布合理,与模版蛋白的主链a碳原子的均方根差RMSD值为0．547742,在合理范围之内,表明Parasporin-4蛋白模型良好。研究结果为抗癌晶体蛋白的抗癌的分子机制及其定向改造提供了结构信息。     

P53蛋白质R175残基替换的分子动力学研究

利用Ｐ５３蛋白核心区晶体结构作分子动力学研究发现,除了生经方面的稳定性之外,该区还具有分子动力学上的高度稳定性。在此基础上作的Ｒ１７５残基替换分子动力学研究显示,Ｐ５３蛋白质核心区１７５位点精氨酸被其他残基替换后能引起Ｐ５３蛋白质核心区Ｌ２、Ｌ３结构域间的密切联系趋于松散,下沉遥空间构象发生改变并使整个核心区结构稳定性受到破坏。这一研究从三维结构变化上,直观地解释了Ｒ１７５钱基替换造成的５３蛋白质     

2.2埃分辨率B链N端去三肽猪胰岛素(DesB1-3INS)的晶体结构研究

应用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术和立体化学制约最小二乘精化技术,测定了２．２Ａ。分辨率ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ的晶体结构。晶体属于Ｒ３空间群。精化后的结构模型最终Ｒ因子为０．１７８,同标准键长、键角的均方根偏差分别为０．０１７Ａ。和２．９９°。从电子密度图与模型的拟合来看,独立区内两个分子Ｂ链Ｎ端残基的表现十分清晰,相对于三方二锌猪胰岛素的两个分子,ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ分子Ｉ中Ｂ链Ｎ端的构象发生了变化     

天花粉蛋白T18肽片段的溶液构象及T14,TDK和T18肽…

用＾１Ｈ ＮＭＲ法测定Ｔ１８肽在ＤＭＳＯ（ＭＳ１８）和５０％六氟异丙醇（ＦＰ１８）中的溶液构象。ＭＳ１８含有Ｉｌｅ３￣Ｇｌｕ７和Ａｌａ１２￣Ｇｌｎ１６两段β－折叠链;而ＦＰ１８则转变为α－螺旋结构。综合分析Ｔ１４,Ｔ１８和ＴＤＫ三个模型肽的结构性质和稳定性,比较肽链序列和溶剂作用,提出肽链局部优势结构的概念,并据此讨论天花粉蛋白小结构域折叠起始过程。     

天花粉蛋白T18肽片段的溶液构象及T14、TDK和T18肽构象比较

用１ＨＮＭＲ法测定Ｔ１８肽在ＤＭＳＯ（ＭＳ１８）和５０％六氟异丙醇（ＦＰ１８）中的溶液构象．ＭＳ１８含有Ｉｌｅ３～Ｇｌｎ７和Ａｌａ１２～Ｇｌｎ１６两段β－折叠链;而ＦＰ１８则转变为α－螺旋结构。综合分析Ｔ１４,Ｔ１８和ＴＤＫ三个模型肽的结构性质和稳定性,比较肽链序列和溶剂作用,提出肽链局部优势结构的概念,并据此讨论天花粉蛋白小结构域折叠起始过程．     

维甲酸结合蛋白的分子可及性与该蛋白和配体相互作用的关系的研究

从蛋白质可及性分析的角度研究了ＥＲＡＢＰ与ＲＡ的相互作用模式,在原子水平和残基水平上计算了四个与维甲酸结合蛋白（ＥＲＡＢＰ）有关的分子的可及性,这四个分子是ＥＰＡ（无配体结晶生成的ＥＲＡＢＰ）,ＥＰＢ—ＲＡ（ＥＲＡＢ和配体雏甲酸ＲＡ,并对其进行分析比较。分析结果表明,ＲＡ在结合蛋白中采取β－芷香酮环向里,羧基端向外的构象形式;围绕结合部位有２４个残基;在结合配体ＲＡ时,在结合配体ＲＡ时,结合蛋白将发生构象变化,变化的结果是结合部位空穴的暴露程度增大。     

重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．     

重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

对氨基苯甲酸酯同系物形成细胞色素P450代谢中间体络合物的定…

细胞色素Ｐ４５０（Ｐ４５０,Ｅｃ,１．１４．１４．１）是一种十分重要的催化氧化反应的酶,本文测定了１２个对氨基苯甲酸酯用系物与Ｐ４５０相互作用而形成Ｐ４５０代谢中间体络合物的活性,用半经验分子轨道法ＭＮＤＯ－ＰＭ３计算得到了这些同系物的分子轨道指数,并用逐步多元回归分析法导出了活性与分子轨道指数及正辛醇／水分配系数的对数值之间的定量结构与活性关系。结果表明,对苯氨基苯甲酸脂同系物形成Ｐ４５０代谢中     

鸡蛋花花叶病毒3'端序列的克隆与分析

根据烟草花叶病毒组（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）３’端非编码区保守区域,人工合成下游引物Ｐ１,Ｐ２,Ｐ３,分别以这些引物引导在反转录酶作用下合成双链ｃＤＮＡ,并克隆到ｐＢＳ载体上。ＨｉｎｄⅢ＋ＰｓｔⅠ双酶切分析重组子后,得到１５个阳性重组子,其中重组子ｐＢＦ３含有２ ４３２ ｂｐ外源ＤＮＡ。序列分析结果表明：该２ ４３２ ｂｐ的序列含２个开放读框,即鸡蛋花花叶病毒移动蛋白基因序列和外壳蛋白基因序列     

双丁酰环磷酸腺苷耐人肝癌细胞株SMMC－7721表面N－糟链类型及天线数的影响

本文采用系列凝集素柱层析法,并配合外切精苷酶研究了在双丁酰环磷酸腺苷（ｄＢ－ｃＡＭＰ）作用１～５天过程中人肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７７２１细胞表面Ｎ－糖链类型及复杂型糖链天线数的变化。结果表明,ｄＢ－ｃＡＭＰ促进３Ｈ—Ｍａｎ参入细胞表面Ｎ－糖链,使高甘露糖型Ｎ－糖链的百分比下降,并促进二天线Ｎ－糖链的生物合成。使多天线特别是四天线和Ｃ２Ｃ２Ｃ６三天线Ｎ－糖链的百分比减少．结果提示,Ｎ－糖链结构的这些变化可能是ｄＢ－ｃＡＭＰ诱导ＳＭＭＣ－７７２１细胞向正常方向分化的结果。     

紫茉莉抗病毒蛋白（Mirabilis antiviral protein，MAP）的空间结构和与底物相互作用的模拟研究

首先应用同源构筑方法建立了低序列同源性的紫茉莉抗病毒蛋白（ＭｉｒａｂｉｌｉｓａｎｔｉｖｉｒａｌＰｒｏｔｅｉｎ,ＭＡＰ）的空间结构,然后对此粗结构进行了分子动力学优化。最后通过对ＭＡＰ,ＴＣＳ与其底物类似物的相互作用,了解ＲＩＰ特异糖苷酶活性的机制。结果表明模拟结构是合理的。ＲＩＰ特异糖苷酶活性主要是由于酶的活性口袋与底物的特殊构象相互匹配。     

与麦芽糖结合蛋白构象有关的单克隆抗体的制备

利用麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）在大肠杆菌中的高效表达,分别采用亲和层析和变性复性,疑胶过滤的方法纯化了可溶性和包涵体部分的ＭＢＰ。将得到的这两种构象不同的ＭＢＰ分别免疫小鼠并进一步筛选和克隆,各得到５株单克隆抗体株。经制备腹水获得抗体后,地其和构象不同的麦芽糖结合蛋白的结合能力的测定,发现由包涵体部分的ＭＢＰ轩和筛选得到的单克隆抗体中有两对变性蛋白具有更高的结合能力。