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1.
以人成骨肉瘤细胞株HOS-8603为热休克模型,在利用DDmRNA方法筛选和克隆了一个热休克后表达受抑基因的cDNA片段的基础上,以该片段为探针,筛选HOS-8603细胞的cDNA文库,获得该基因的全长cDNA克隆(HSSG-1);DNA序列测定表明该cDNA全长1456bp,编码276个氨基酸,经计算机辅助分析,该cDNA序列尚未被报道。经RNA斑点杂交证实,该基因的表达于多种组织细胞之中,并且 相似文献
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中国人r——干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达 总被引:2,自引:0,他引:2
应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-r-cDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-rcDNA序列存在多态性的推论。在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-r cDNA克隆到原核表达质粒pBV220 PRPL启动子下游,转化大肠杆菌DH5a,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-r cDNA,其表达水平占全菌可溶性总 相似文献
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t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
应用PCR方法,在t-PA cDNA5'端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTE-Y,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选t-PA cDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDS-PAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定t-PA的活性。Mut^s表型菌表 相似文献
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重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性 总被引:1,自引:0,他引:1
报告了人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用AflⅡ酶剪除BMP-2cDNA中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的cDNA3′端0.36kb基因片段克隆于大肠杆菌表达载体pMX-1质粒的ATG下游,受控于PLPR启动子。重组子以大肠杆菌DH5α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经42℃6h诱导后,在SDS-PAGE上出现一条新蛋白带,分子量约为12kD,约占菌体总蛋白的20%。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)。小鼠肌肉植入试验发现。rhBMP-2m植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明rhBMP-2m具有明显的诱导新骨形成的作用。 相似文献
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人粒细胞集落刺激因子hG—CSF cDNA在大肠杆菌中表… 总被引:6,自引:0,他引:6
在不改变编码蛋白质氨基酸序列的前提下,利用合成DNA接头的方法,在原始cDNA克隆基础上,构建了5'端密码子富含AT的hG-CSF cDNA突变体,使hG-CSF cDNA得以在大肠杆菌中表达,但表达水平很低,借助相同的手段,在hG-CSF cDNA 5'端增加24核苷酸对的FLAG肽编码序列,构建了hG-CSF杂合蛋白(在hG-CSF成熟蛋白N末端增加8氨基酸残基FLAG肽,二者结合点为肠激肽酶 相似文献
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水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化 总被引:2,自引:0,他引:2
曾以水稻蜡质基因5’调控区内一段31bp片段为探针,用酵母单杂交法从水稻cDNA文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此31bp片段结合的cDNA克隆,现将其中的pC73克隆中的插入片段c73连接到含His6的表达载体pET28-c(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,并用Ni-NTA树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞 相似文献
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天麻抗真菌蛋白GAFP—Ⅰ的一级结构和cDNA克隆 总被引:10,自引:0,他引:10
天麻抗真菌蛋白GAFP-Ⅰ是从天麻顶生球茎分离的14kD蛋白,它能强烈抑制腐生真菌菌丝的生长,在天麻限制和防止密环菌侵染球茎的防卫机制中起重要作用。本文报告GAFP-I的一级结构和cDNA克隆的核苷酸序列。首先测得N-末端7个氨基酸序列为SDRLNSG-用以合成 一个简并引物,由天麻营养球茎提取RNA,通过3‘-RACE技术扩增到一个600bp的cDNA片段,直接克隆到pGE-T载体中测定核苷酸序 相似文献
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在以前工作中我们从人精子中分离纯化出一种与生育有关的糖蛋白,命名为BS-17。本文用其多克隆抗血清从人睾λgt11cDNA表达库中克隆了编码BS-17的cDNA片段。序列分析表明BS-17cDNA片段长791bp,开放阅读框架558bp,可编编码186个氨基酸。经数据库检索,该cDNA片段与人Calpastatin蛋白质羧基末端同源性为99.5%。用cRNA进行组织原位杂交结果表明,BS-17基因 相似文献
10.
人骨形成蛋白2A活性片段在大肠杆菌中的高效表达 总被引:6,自引:0,他引:6
将编码人骨形成蛋白2A(BMP2A)C端173个氨基酸(BMP23)和134个氨基酸(BMP24)的DNA基因片段分别重组克隆进入PL启动子控制下的表达载体,构建了表达质粒pBLBMP23和pBLBMP24,分别转化大肠杆菌进行表达研究.SDS-PAGE分析温敏诱导的表达菌,可以分别观察到分子量为20kD和15.5kD的高表达条带,与理论计算的分子量一致,表达量分别占细菌蛋白质总量的10%和20%左右。表达产物经包含体制备达到80%以上纯度。N端序列测定的15个氨基酸,与重组cDNA基因编码的序列相同.BMP23和BMP24包含体经复性处理后,得到二聚体分子蛋白质条带,与骨基质胶原重组后在大鼠体内测活,观察到BMP23诱导软骨细胞生成,BMP24刺激丰富的骨样胶原组织合成. 相似文献
11.
小麦丛矮病毒NS蛋白基因的克隆及序列分析 总被引:2,自引:2,他引:0
利用与N蛋白mRNA3'末端顺序相同的20寡聚核苷酸引物,通过点杂交、限制性内切酶分析从小麦丛矮病毒(WRSV)cDNA文库中筛选到编码N蛋白基因下游顺序的cDNA克隆。序列分析表明,该cDNA片段含有一编码的40kD蛋白的开放读框。将该读框的全长cDNA经PCR扩增后,克隆到pGEX-3X上,在大肠杆菌DE3中用IPTG诱导表达,经蛋白质印迹鉴定,该基因为小麦丛矮病毒NS蛋白基因。 相似文献
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日本血吸虫中国大陆株TPI基团的克隆及其表达产物特性 总被引:1,自引:1,他引:1
磷酸丙糖异构酶(TPI)是血吸虫病疫苗重要的候选抗原基因之一。参考日本血吸虫已发表的TPI cDNA序列,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法快速克隆出一大小约800bp的DNA片段。DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段即为日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(SjTPIc)基因。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约54kD。用谷胱甘肽琼脂 相似文献
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
用PCR法从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中快速克隆出一大小为600bp左右的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-14FABPc)基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-2T中,表达的GST融合蛋白分子量是41kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达25mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其用作疫苗分子创造了条件。 相似文献
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及其在大肠杆 … 总被引:3,自引:2,他引:3
用PCR法从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中快速克隆出一大小为600bp左右的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj-14FABPc)基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-2T中,表达的GST融合蛋白分子量是41kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达25mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋 相似文献
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人组织性纤溶酶原激活物衍生物在大肠杆菌硫氧化还原蛋白融合表达系统中的 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:克隆含tPA中355个氨基酸密码子(1-3和176-527氨基酸)的cDNA序列(tPA355),将其在大肠杆菌融合蛋白表达系统中表达,并在体外复性使其具有激活纤溶酶原的生物活性。方法:采用RT-PCR技术从人黑色素瘤细胞Bowes中克隆出tPA355 cDNA,然后在pET32a(+)BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中表达,将表达出的融合蛋白Trx-tPA355(Thioredoxin,Trx)包涵体在体外进行变性、复性和纯化以使其具有激活纤溶酶原的生物活性。结果:测序结果表明本研究克隆的编码tPA中355个氨基酸密码子的cDNA序列与美国专利(公开号:5,587,159)中对应的序列完全一致,将其在pET32a(+)/BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中表达可获得稳定表达的融合蛋白Trx-tPA35 相似文献
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一个新的水稻MADS—box基因的克隆及表达分析 总被引:2,自引:0,他引:2
根据MADS-box基因保守区结构,设计简并性引物,利用3'RACE从水稻(Oryza sativa L.)中克隆了1个新的水稻MADS-box基因的cDNA片段,同时利用5&RACE获得了全长cDnA命名为FDRMADSS。序列分析表明,该cDNA全长1406bp,开放阅读框共编码233个到,具有典型的植物MADS-box基因的结构。推测的氨基酸序列与拟南芥的MADS-box基因,AGL14同 相似文献
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将尿激酶原(pro-UK)cDNA和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)A链cDNA克隆到M13mp18中,经过二次寡核甘酸诱导的大片段定点删除和一次寡核苷酸诱导的多位点突变,得到u-PA(Leu144-Gly408)/t-PA(Ser1-Thr263)(ut-PA)融合基因.将ut-PA融合基因克隆到表达载体pCM-βneo中,与pCM-dhfr共转染CHO/DHFR-细胞,筛选稳定表达株.收集无血清表达上清,经苯甲脒柱纯化得到ut-PA纯品,SDS-PAGE和纤维蛋白自显影显示ut-PA有两种分子量形式,分子量分别为68kD和61kD.纤维蛋白亲和性试验表明,LUK(低分子量尿激酶)对纤维蛋白没有亲和性,而含有LUK的ut-PA则对纤维蛋白表现出很强的亲和性,但ut-PA的亲和性略低于亲本t-PA. 相似文献
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淀粉样前体蛋白(APP)是阿尔茨海默氏病(AD)病因学中重要的分子,但其正常的生理功能尚不清楚.为了研究细胞内过量产生其各种片段对细胞生理机能的影响.将人APP695cDNA中编码C端105个氨基酸残基的DNA片段重组到真核表达载体pDORneo中形成重组质粒pDOR-neo-CT.然后用脂质体将其转染到人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中.用800μg/mlG418筛选获得了在mRNA和蛋白质水平均表达相应片段的稳定细胞系.MTT和LDH分析表明,APPC端的表达未能对SH-SY5Y细胞产生明显的毒性作用. 相似文献
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产气肠杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性?… 总被引:3,自引:0,他引:3
用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆出0.9kb的DNA片段,经DNA测序证明是α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,α-ALDC)基因。将α-ALDC基因重组到质粒,pBV220后,转化大肠杆菌,经筛选获得的高效表达的重组子菌株。 相似文献
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汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
从汉坦病毒陈株感染的VeroE6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kbcDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX4T1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为GSTNP融合蛋白。SDSPAGE检测表达蛋白分子约72kD左右。Westernbloting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76118株相比存在某些差异。 相似文献