表面展示表达植酸酶的重组酿酒酵母构建及酒精发酵

以淀粉为原料的同步糖化发酵是目前乙醇生产的主要途径之一。然而原料中含有的植酸不仅影响酒精发酵效率,而且也会导致环境中难以被植物吸收的磷含量的增加,加剧环境污染。将来源于大肠杆菌的植酸酶基因与酵母编码α-凝集素C端编码序列连接并置于α-因子分泌信号肽下游,构建植酸酶表面展示表达重组载体pMGK-AG-phy并转化工业酿酒酵母,成功获得了在细胞表面锚定表达植酸酶的重组菌PHY。重组酵母的植酸酶表达水平达到6.4 U/g(菌体湿重),其最适温度为55℃,最适pH 4.0,在pH 3.5–4.5范围内具有较高的活性。以玉米粉为原料的同步糖化发酵实验表明,重组酵母PHY的生长速度高于出发菌株,同时酒精产量相较于出发菌株提高了3.7%。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了91%。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量,提高了酒糟的利用价值,减少磷排放,对燃料酒精的环境友好生产具有重要的借鉴意义。     

酿酒酵母细胞表面展示技术在燃料乙醇生产中的应用及研究进展

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统,具有糖基化作用及蛋白翻译后折叠等优势,更利于基因工程操作。近年来,酵母细胞表面工程作为一种新兴策略来固定化淀粉水解酶、纤维素水解酶以及木聚糖降解酶,从而应用于燃料乙醇的生产。文中着重介绍了酵母细胞表面展示系统的基本原理、研究现状以及在生物乙醇生产中的应用前景及所面临的挑战。     

酿酒酵母表面展示鲑鱼降钙素多肽的研究

目的:实现酿酒酵母表面展示鲑鱼降钙素.方法:人工合成鲑鱼降钙素(Salmon cacitonin,sCT)编码基因,克隆到表面展示载体M-pYD1上.用NocⅠ酶切重组质粒M-pYD1-sCT和空白质粒M-pYD1,回收sCT和V5表达框片段后分别以LiAC法转化酿酒酵母EBY100菌株,分别得到重组酵母yAGA2-sCT和yAGA2-V5.两种重组酵母分别经半乳糖诱导表达后,采用FITC荧光标记酵母表面展示的sCT和V5多肽,分别用荧光显微镜和流式细胞仪进行定性和定量分析.结果:诱导12h后,荧光显微镜下清晰观测到了工程菌表面有重组sCT,流式细胞分析结果表明10000个细胞中65.2%的yAGA2-sCT菌株表达了外源sCT,52.4%的yAGA2-V5菌株表达V5.结论:利用酿酒酵母表面展示鲑鱼降钙素多肽获得了成功,为口服型鲑鱼降钙素的研发奠定了基础.     

利用Flo1p锚定蛋白在酿酒酵母表面展示三种纤维素酶的纤维素乙醇发酵

为了简化纤维素乙醇生产工艺,实现纤维素利用与乙醇发酵的同步进行,通过酵母细胞表面展示技术,以酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为受体,通过絮凝素(Flo1p)锚定方式,将来自丝状真菌里氏木霉Trichoderma reesei的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ(BGLI)展示在细胞表面,构建同时表达3种纤维素酶的酵母菌群系统。经过免疫荧光验证展示酶的细胞蛋白定位,酶活测定,乙醇发酵性能验证,结果表明:展示表达的3种纤维素酶具有良好的稳定性和功能活性;在EGII、CBHII和BGLI协同作用下重组酵母菌株能够水解溶胀磷酸纤维素(Phosphoric acid swollen cellulose,简称PASC)并产生乙醇,乙醇浓度达到最大值0.77 g/L,乙醇产量为0.35 g/g,相当于理论值的68.6%。本研究成功构建了利用Flo1p作为锚定蛋白的絮凝素展示系统,初步实现了纤维素利用与乙醇发酵的同步进行,为利用酿酒酵母表面展示技术固定并表达纤维素酶提供了一定的理论依据。     

酿酒酵母表面展示表达系统及应用

酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统,即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,利用酿酒酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制（GPI锚定）使靶蛋白定位于酵母细胞表面并进行表达。它利用细胞表面展示技术使外源蛋白固定化于细胞表面,从而生产微生物细胞表面蛋白,可应用于生物催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、生物传感器、抗原／抗体库构建、免疫检测及亲和纯化、癌症诊断等领域。国内对这一方面研究较少,本文主要介绍了该技术的基本原理、研究现状、应用及其发展前景。     

果胶酯酶的研究进展

果胶酯酶(PME)或称果胶甲基酯酶,它是果胶酶系的一种,能从果胶中脱去甲氧基,生成果胶酸,属于皂化酶.它在食品工业中有着广泛用途,尤其是在果品工业中.对果胶酯酶的研究概况进行了综述和展望,为果胶酯酶的基因工程研究提供参考.     

甲基对硫磷水解酶的酿酒酵母表面展示及在甲基对硫磷降解中的应用

PCR扩增假单胞菌WBC-3的甲基对硫磷水解酶基因,插入表面展示质粒pYD1的多克隆位点,构建pYD1-MPH重组质粒。重组质粒转化酿酒酵母EBY100,2%半乳糖诱导甲基对硫磷水解酶表达,并利用免疫荧光检测甲基对硫磷水解酶在酿酒酵母细胞表面的表达展示。研究了表面展示甲基对硫磷水解酶的酶学性质和酵母工程菌对水体中甲基对硫磷的降解效果。结果表明成功构建具有全细胞甲基对硫磷水解酶催化活性的酵母工程菌,经2%半乳糖诱导48 h,表面展示甲基对硫磷水解酶比酶活力为18.2 U/mg细胞干重。表面展示甲基对硫磷水解酶的最适作用pH为9.5,最适作用温度为30℃,在p H4.0-10.5之间和45℃以下稳定性较好,Mn2+、Co2+、Zn2+、Ca2+、Hg2+、K+、Ni2+对表面展示甲基对硫磷水解酶活性有激活作用,Na+、Fe3+、Ag+对展示酶活力有抑制作用。工程菌在1 h内对淡水中20 mg/L的甲基对硫磷的降解率在80%以上。     

菊粉酶基因在酿酒酵母中的表达及乙醇发酵

以乙醇耐受力较强的酿酒酵母为受体菌,构建了能够分泌菊粉酶的基因工程菌并进行了菊芋粉的生料发酵。首先,以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus中的基因组DNA为模板,PCR扩增菊粉酶编码基因inu,分别使用菊粉酶自身启动子和酵母磷酸甘油激酶 (Phosphoglycerate kinase,pgk) 启动子,构建重组表达质粒HO/p-inu和HO/pgk-inu。经NotⅠ线性化后,采用电击法转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae 6525,分别得到含菊     

表面展示工程在酒精发酵方面的应用

目前,表面展示工程作为一种新型的极具应用潜力的技术手段,在组合文库的筛选、蛋白质工程、燃料乙醇的生产和生物修复等技术中已经扮演了极其重要的角色.介绍了表面展示工程在酒精发酵方面的应用,重点阐述酒精发酵过程中酶类展示原理和全细胞催化的应用前景.     

基于壳聚糖结合模块构建新型酿酒酵母孢子表面展示系统

【目的】基于当前细胞表面展示体系存在的问题,旨在构建一个新型的普适性强、抗逆性好、高效稳定的酿酒酵母孢子表面展示系统。【方法】首先,根据酵母孢子固定化酶的特性,通过查阅文献寻找潜在的与孢子壁壳聚糖层高度亲和的壳聚糖结合模块;其次,利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)与结合模块融合表达,在体外和孢子内分别验证结合模块与孢子壁的亲和能力;之后,选择Saccharomyces cerevisiae AH109来源的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,MEL1)评估新型展示体系的效能。【结果】首先,选择Paenibacillussp. IK-5来源壳聚糖酶的碳水化合物结合模块32 (carbohydrate binding module 32,CBM32)作为壳聚糖结合模块。其次,将大肠杆菌表达纯化后的融合蛋白CBM32-GFP与dit1Δ孢子共孵育,通过GFP荧光定位以及荧光强度验证CBM32在体外与孢子壁具有较好的亲和能力;CBM32-GFP在dit1Δ孢子内的荧光定位与结合能力证明了其在孢子内能够与孢子壁紧密结合;最后,以MEL1替换GFP应用到新型展示体系中,与只表达MEL1的孢子相比,CBM32-MEL1孢子酶活不仅提高了68.65%,最高酶比活力达到460.59 U/g DCW (dry cell weight, 菌体干重),重复使用能力也得到了显著提高;此外,该体系提高了MEL1的稳定性和可操作性。【结论】本研究首次提出利用结合模块来构建一个新型酿酒酵母孢子表面展示体系,为真核来源的多糖基化位点修饰以及多亚基结构蛋白提供了可靠的细胞表面展示平台,为实现工业化应用孢子固定化酶提供了理论依据。     

高效合成葡萄糖二酸酿酒酵母工程菌的构建

葡萄糖二酸是天然存在的一种重要二元酸,其在医疗保健和化工工业等领域具有很高的实际应用价值,因此被称为"最具价值的生物炼制产品之一".以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为底盘微生物,文中考察了过量表达肌醇转运蛋白Itr1、融合表达肌醇加氧酶和葡萄糖醛酸脱氢酶以及弱化表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因...     

酿酒酵母SRP40基因对细胞耐受性影响的研究

【目的】本论文研究酿酒酵母srp40³⁹突变基因对酵母细胞异丁醇耐受性的影响。【方法】首先,以酿酒酵母野生型W303-1A和突变株EMS39染色体DNA为模板克隆野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因;然后,将野生型SRP40基因和srp40³⁹突变基因分别连接到质粒YCplac22上,构建质粒YCplac22-SRP40和YCplac22-srp40³⁹。将质粒YCplac22-SRP40、YCplac22-srp40³⁹以及YCplac22空质粒分别转化入野生型酿酒酵母W303-1A中,分别得到W303-1A-SRP40工程菌、W303-1A-srp40³⁹工程菌和W303-1A-control工程菌。将3株工程菌分别置于含1.0%异丁醇、1.3%异丁醇、8.0%乙醇和0.5%异戊醇的CM培养基中进行发酵,测定细胞密度(OD₆₀₀)和生长情况,并计算2–10 h的比生长速率（μ）。将3株工程菌于55°C热激4 min后做稀释...     

酿酒酵母L610利用菊糖生产乙醇发酵条件的研究

以1株能够直接利用菊糖产乙醇的酿酒酵母L610为出发菌株,对其利用菊糖生产乙醇的发酵条件进行了一系列研究。结果表明,L610最适乙醇发酵温度为37℃,且40℃高温发酵对其产乙醇能力无显著影响;L610对酸性发酵环境有良好的耐受性,当发酵液p H值降至3.5时,其糖醇转化率及乙醇产量仍保持较高水平;以0.025~0.10 vvm的通气量通气12 h有利于L610发酵菊糖产乙醇;L610对350 g/L的高浓度菊糖有良好的转化率,乙醇浓度和生产强度分别达到129 g/L和1.35 g/(L·h);当直接以300 g/L菊芋粗粉为唯一底物进行发酵时,L610发酵产乙醇浓度达到89.6 g/L,为理论产量的78.1%。本研究所取得的成果为酿酒酵母一步法发酵菊芋生产乙醇的工业化发展提供参考。     

代谢工程改造酿酒酵母提高法尼醇产量

[目的]法尼醇(FOH,C15H26O)是一种具有芳香气味的非环状倍半萜醇,被广泛应用于化妆品和医学药物的工业化生产,也可作为航空燃料的理想替代品.具有食品级安全性的酿酒酵母细胞能够合成内源性法尼醇,但其产量很低,无法满足工业生产的需要.因此,需要采用代谢工程手段,改造法尼醇合成途径,以有效提高法尼醇在酿酒酵母中的产量...     

高效组成型分泌表达木素过氧化物酶酿酒酵母工程菌的构建

【目的】为了获得高产木素过氧化物酶酿酒酵母工程菌。【方法】本研究从黄孢原毛平革菌中克隆了木素过氧化物酶(lignin peroxidases,LiP)基因,全长2193 bp,编码371个氨基酸,并与来源于酿酒酵母的PGK启动子序列、来源于pPIC9K质粒的α-信号肽序列以及来源于pSH65质粒的CYC1终止子序列通过重叠延伸PCR构建完整表达盒(PαLiC),利用rDNA整合法构建木素过氧化物酶酿酒酵母表达载体,实现木素过氧化物酶在酿酒酵母中的多拷贝表达。利用数字微滴PCR技术对拷贝数进行鉴定,探究拷贝数与蛋白表达量之间的关系。【结果】通过rDNA整合法得到拷贝数为1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的木素过氧化物酶酿酒酵母工程菌,通过对其酶活测定,表明当拷贝数为7时,酶活力最高,为367U/L。【结论】本研究在酿酒酵母中表达了木素过氧化物酶,研究了其基因拷贝数与酶活性的关系,对木质素降解技术的发展具有重要意义。     

双孢蘑菇酪氨酸酶基因在酿酒酵母中的异源表达及其酶学特性

【目的】在酿酒酵母中异源表达双孢蘑菇来源的酪氨酸酶基因PPO2,并研究酪氨酸酶在酿酒酵母胞内及胞外的酶学特性。【方法】提取双孢蘑菇总RNA,通过RT-PCR克隆酪氨酸酶基因PPO2,构建表达载体pSP-G1-PPO2,并转化至酿酒酵母进行表达,采用镍亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。【结果】在酿酒酵母中正确表达了大小为65 kDa的酪氨酸酶蛋白。重组酶能催化底物酪氨酸产生黑色素。体外活性测定表明,酪氨酸酶催化最适温度为45°C,以酪氨酸和多巴为底物时最适pH分别为7.0和8.0。在酿酒酵母中测得底物酪氨酸浓度低于2.5 mg/mL时,黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性。【结论】来源于双孢蘑菇的酪氨酸酶基因PPO2在酿酒酵母中成功表达,重组酶具有良好的酶学特性。利用酪氨酸酶产物黑色素的产量与底物浓度呈现正相关性这一特性,可将其作为细胞酪氨酸产量的传感器,为高通量筛选酪氨酸高产菌株提供了思路。     

Crabtree-negative characteristics of recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae

For recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae, ethanol yield and productivity is substantially lower on xylose than on glucose. In contrast to glucose, xylose is a novel substrate for S. cerevisiae and it is not known how this substrate is recognized on a molecular level. Failure to activate appropriate genes during xylose-utilization has the potential to result in sub-optimal metabolism and decreased substrate uptake. Certain differences in fermentative performance between the two substrates have thus been ascribed to variations in regulatory response. In this study differences in substrate utilization of glucose and xylose was analyzed in the recombinant S. cerevisiae strain TMB3400. Continuous cultures were performed with glucose and xylose under carbon- and nitrogen-limited conditions. Whereas biomass yield and substrate uptake rate were similar during carbon-limited conditions, the metabolic profile was highly substrate dependent under nitrogen-limited conditions. While glycerol production occurred in both cases, ethanol production was only observed for glucose cultures. Addition of acetate and 2-deoxyglucose pulses to a xylose-limited culture was able to stimulate transient overflow metabolism and ethanol production. Application of glucose pulses enhanced xylose uptake rate under restricted co-substrate concentrations. Results are discussed in relation to regulation of sugar metabolism in Crabtree-positive and -negative yeast.     

Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae

Because of many advantages, the yeast Saccharomyces cerevisiae is increasingly being employed for expression of recombinant proteins. Usually, hybrid plasmids (shuttle vectors) are employed as carriers to introduce the foreign DNA into the yeast host. Unfortunately, the transformed host often suffers from some kind of instability, tending to lose or alter the foreign plasmid. Construction of stable plasmids, and maintenance of stable expression during extended culture, are some of the major challenges facing commercial production of recombinant proteins. This review examines the factors that affect plasmid stability at the gene, cell, and engineering levels. Strategies for overcoming plasmid loss, and the models for predicting plasmid instability, are discussed. The focus is on S. cerevisiae, but where relevant, examples from the better studied Escherichia coli system are discussed. Compared to free suspension culture, immobilization of cells is particularly effective in improving plasmid retention, hence, immobilized systems are examined in some detail. Immobilized cell systems combine high cell concentrations with enhanced productivity of the recombinant product, thereby offering a potentially attractive production method, particularly when nonselective media are used. Understanding of the stabilizing mechanisms is a prerequisite to any substantial commercial exploitation and improvement of immobilized cell systems.     

酵母Sirtuins在细胞寿命中的作用

酿酒酵母(以下简略为酵母)作为寿命分析模型广泛应用于寿命研究领域。酵母寿命分析方法有两种,分别是复制型酵母寿命分析法和时序型酵母寿命分析法。目前,通过酵母寿命分析模型已识别出包括SIR2在内的多个寿命调节基因。SIR2是目前较好的被确立起来的寿命调节基因,具有NAD依赖型脱乙酰化酶的活性,从原核生物到真核生物都有良好的保守性。Sirtuins (Sir2蛋白家族的总称)在细胞内具有功能上的多样性,其中包括对于压力耐受的调节、基因转录的调节、代谢通路的调节以及寿命调节作用等。Sir2是Sirtuins家族最早发现的成员,其功能是参与异染色质结构域转录的沉默调节,同时还参与复制型酵母寿命的调节。已证明,SIR2的缺失会缩短酵母的寿命,基因表达的增高会延长寿命。Sir2的高等真核生物的同源蛋白也被证实参与衰老相关疾病的调节。本文中,我们将阐述Sir2以及Sir2的酵母同源蛋白Hst1-Hst4的功能,以及由它们调节的酵母寿命。