小麦泛素融合降解蛋白基因的克隆及特征分析

酵母UFD1基因编码的泛素融合降解蛋白是泛素依赖性降解系统或泛素融合降解途径中的一个关键因子.利用RT-PCR技术在小麦(Triticum aestivum L.)中分离到一个UFD1类似基因.该基因的编码区长948 bp,编码长315个氨基酸的多肽,其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥UFD1类似蛋白有74%的同源性.在多肽链的N-端具有在真核生物中高度保守的UFD1结构域.我们将该基因定位在小麦的第六染色体群并将其命名为TUFD1.South-ern杂交和数据库搜索表明植物的UFD1基因是单拷贝或低拷贝的.无论是在单子叶中还是在双子叶植物中,UFD1蛋白都高度同源.除了N端UFD1结构域外,该类蛋白还有3个高度保守的C端结构域.TUFD1基因在小麦幼苗的根、茎、胚芽鞘、叶片以及幼穗和腊熟期子粒中呈组成性表达.     

眼镜王蛇线粒体基因组全序列分析

参照近缘物种线粒体基因序列共设计和合成了8对引物, 结合Ex Taq-PCR、TA克隆和步移测序技术, 文章首次获得眼镜王蛇线粒体基因组全序列(GenBank登录号: EU_921899)。该基因组全长17 267 bp, 共编码13个蛋白、2个rRNA、23个tRNA-- 其中tRNA-Ile基因发生了复制, 属于一种新的蛇类物种线粒体基因排列模式, 另外还含有2个非编码的富含AT的控制区。除了8个tRNA基因和1个蛋白基因由L链编码外, 其余均由H链编码, 其中H链编码基因的A和T含量接近, 而L链上A的含量则明显高于T。基于21种蛇合并的“12S＋16S”rRNA基因序列的系统发育分析表明, 眼镜王蛇属与眼镜蛇属亲缘关系较近, 两者与环蛇属共同构成一个单系群。作为国内外眼镜王蛇线粒体基因组全序列的首次报道, 上述结果对于蛇类物种分子系统发育和进化研究具有重要意义。     

桑泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的:利用3’RACE技术克隆植物泛素基因,是进一步研究其功能的基础。方法:本研究从桑树(丰驰桑)(Morus bomby-cis)幼叶中提取总RNA,反转录成cDNA,根据已报道的泛素基因序列设计1条正向引物,利用3’RACE(Rapid Amplification of cDNAEnd)技术进行扩增。结果:扩增出1条690 bp的泛素基因片段。该片段5’端为编码156个氨基酸残基的阅读框,3’末端有219bp的非翻译区。结论:同源分析表明,此cDNA序列为泛素延伸蛋白基因(Genebank登录号为DQ839403)。用Genedoc软件对该片段编码的氨基酸序列进行同源性分析的结果表明:桑树泛素延伸蛋白与马铃薯、烟草、陆地棉、黄瓜的泛素延伸蛋白以及苜蓿的核糖体S27A蛋白的同源性都在96%以上。     

牡丹泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的：利用巢式PCR技术克隆牡丹泛素延伸蛋白基因,为泛素蛋白降解系统研究奠定基础,也为牡丹基因表达水平研究提供内参基因。方法：从牡丹（Paeonia suffruticosa）叶片、花瓣、花萼中提取总RNA,反转录得到cDNA,根据已报道的泛素延伸蛋白基因设计巢式引物进行PCR扩增。结果：得到一条389bp的牡丹泛素延伸蛋白基因片段,该片段编码129个氨基酸残基。结论：通过Blastn比对分析表明：牡丹泛素延伸蛋白基因与番茄、水稻、拟南芥等植物的泛素延伸蛋白基因一致性达到100%,编码的氨基酸序列同源性达94%以上。确认该片段即牡丹泛素延伸蛋白基因。     

小麦泛素融合降解蛋白基因的克隆及特征分析

酵母UFD1基因编码的泛素融合降解蛋白是泛素依赖性降解系统或泛素融合降解途径中的一个关键因子。利用RT-PCR技术在小麦(Triticum aestivum L.)中分离到一个UFD1类似基因。该基因的编码区长948 bp,编码长315个氨基酸的多肽,其氨基酸序列与GenBank中登录的一个拟南芥UFD1类似蛋白有74％的同源性。在多肽链的N-端具有在真核生物中高度保守的UFD1结构域。我们将该基因定位在小麦的第六染色体群并将其命名为了UFD1。Southern杂交和数据库搜索表明植物的UFD1基因是单拷贝或低拷贝的。无论是在单子叶中还是在双子叶植物中,UFD1蛋白都高度同源。除了N端UFD1结构域外,该类蛋白还有3个高度保守的C端结构域。TUFD1基因在小麦幼苗的根、茎、胚芽鞘、叶片以及幼穗和腊熟期子粒中呈组成性表达。     

广东眼镜蛇蛇毒与眼镜王蛇蛇毒冻干粉的鉴别及质量控制的研究 V．广东眼镜蛇蛇毒与眼镜王蛇蛇毒的氨基酸分析

本文采用日立８３５－５０型氨基酸自动分析仪测定了广东眼镜蛇蛇毒与眼镜王蛇蛇毒的氨基酸成分,结果表明两种蛇毒的氨基酸组成基本相同,但多种氨基酸的含量存在明显差异,为蛇毒鉴别和质控提供实验依据。     

眼镜王蛇三指毒素新cDNA序列的克隆及结构分析

目的:获得眼镜王蛇中多种三指毒素的新的cDNA序列,分析其结构特征,为王蛇三指 毒素基因组特征的研究及重组药物的开发奠定基础.方法:采用类似蛇种的毒素信号肽编码 序列及简并引物获得部分cDNA序列,再通过3'RACE法获得多种编码成熟三指毒素的完整新c DNA序列.通过BLAST检索,利用功能软件构建系统发生进化树进行分析.结果: 获得了眼镜 王蛇6类三指毒素共19条新基因的cDNA序列,GenBank的接收号为DQ273567～DQ273585.这 些cDNA长度都在480bp左右,彼此之间序列相似度均在70%以上,且每类毒素的cDNA都呈现高 度的序列多态性.结论:通过合理的引物设计及3'RACE法成功获得了眼镜王蛇中多种三指毒素的新的编码序列.     

抢救眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）咬伤中毒12例临床报告

本文报告1986年至1992年作者主持抢救眼镜王蛇咬伤中毒12例的临床研究结果,其中男11例,女1例,年龄最大69岁,最小11岁,农民9例.临床主要局部表现为剧痛,肿胀,部分病例有轻度坏死,所有病人均有吞咽困难、眼睑下垂、呼吸困难等神经毒表现。引起自主呼吸停止8例(67%)。心跳停止1例,经抢救死亡1例,死亡率8.33%。抢救存活11例,救活率91.67%。     

广西眼镜王蛇毒两种酸性磷脂酶A2的cDNA克隆及序列分析

从广西眼镜王蛇毒腺中提取总RNA,利用RT－PCR进行体外扩增,获得磷脂酶A2基因（PLA2）,克隆至PUCm－T载体中,筛选出编码两种酸性PLA2（命名为APLA2－1和APLA2－2）的基因,经双向测序测定了它们基因的全序列,由此推导出编码的氨基酸序列,其中APLA2－1的N端15个氨基酸残基序列同其蛋白质直接测序的结果完全一致。利用计算机推算出它们的等电点与实际测定的等电点较为吻合。同源性比较表明,APLA2－1与福建眼镜王蛇和台湾眼镜王蛇毒PLA2成熟肽同源性极高,而APLA2－2与它们的同源性相对较低,并且APLA2－2与APLA2-1芨其他两种眼镜王蛇毒PLA2分子名有一个显著的差别即少一个62－66位的“胰腺环”,可能与物种进化和生物活性有关。     

眼镜王蛇咬伤救治成功临床分析

目的探讨眼镜王蛇咬伤患者的最佳抢救方法。方法对6例眼镜王蛇咬伤患者的抢救过程进行回顾性分析总结。结果通过及时使用抗蛇毒血清、中草药等治疗,6例患者均痊愈出院。结论早期正确局部处理伤口是抢救成功的前提;早期足量应用抗眼镜蛇毒血清和抗银环蛇毒血清治疗是抢救成功的关键;中西医结合治疗是抢救成功和治愈的保证。     

广东眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2的分离纯化及抗血小板聚集作用

目的 研究眼镜王蛇毒中酸性磷酸脂酶Ａ２对血小板的作用。方法 采用ＣＭ－Ｓｅｐｈａｄｅｓｘ Ｃ－２５Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５,ＤＥＡＥ－Ｓｅｐ「ｈａｄｅｘＡ－２５,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５多步柱层析法,聚丙烯酰胺产胶电泳,酸性磷脂酶Ａ２酶活性测定;血小板聚集实验。累进要从粗中分离纯化出一酸性磷脂酶Ａ２单体,分子量为１４ＫＤ;等电点ＰＩ３．８;ＰＬＡ２比值２０μｍｏｌ．ｍｇ＾－１．ｍｉｎ＾－１;小     

广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2的肌毒性研究

目的 研究广西眼镜王蛇毒一种酸性磷脂酶A2（命名为APLA2－1）的肌毒性。方法 大鼠注射2.6mg/kg的APLA2－1后,分别于6h、24h取心肌和骨骼肌通过光镜和电镜观察它们的病理改变;或于0h、3h、6h、12h、24h取尾一胸脉血测定血清肌酶的动态变化。结果 光镜检查显示,大鼠注射APLA2－1 24h后,骨骼肌发生变性和轻度坏死,心肌无明显改变;电镜结果显示,骨骼肌在6h、24h,心肌在24h,细胞超微结构均受到不同程度的破坏;血清肌酶检测显示,注射APLA2－1后,肌酶升高显著,12h达到最大值。结论 广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2具有肌毒性,骨骼肌比心肌对其更为敏感;与别的肌毒性PLA2相比,它的毒力显得较为缓慢温和。     

广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1在不同载体的表达

目的构建广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1(APLA2-1)在不同载体的重组表达质粒,在E.coli中表达APLA2-1并比较不同表达系统对APLA2-1的表达效果。方法将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1(AP-LA2-1)基因克隆至表达载体pBLMVL2和pET28a( ),分别转化入大肠杆菌RR1和BL21,经过诱导表达,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)及Western blot观察重组蛋白表达情况。结果成功构建了重组质粒pBLMVL2-APLA2-1和pET28a-APLA2-1。pBLMVL2-APLA2-1在SDS-PAGE上没见明显表达带,在Western blot上可见一14 kD的表达带。pET28a-APLA2-1在SDS-PAGE上有一明显的18 kD表达条带,表达产物AP-LA2-1约占细菌总量30%,并以包涵体的形式存在。结论APLA2-1可在大肠杆菌中表达,pET28a( )对APLA2-1的表达效果优于pBLMVL2。     

普通离子交换剂用于HPLC柱层析法快速分离眼镜王蛇毒

目的　为了经济快速分离眼镜王蛇(Ophiophagushannah,Oh)蛇毒中的毒素成分。　方法　用普通离子交换剂于高效液相色谱柱 (HPLC) TSKgel SP-Toyopearl 65 0 SF (4× 1 5 0 mm)层析法 ,实验取得最佳分离条件后 ,将蛇毒样品上柱后进行梯度洗脱 ,各洗脱峰收集后在 Cosmosil 5 C4-AR-3 0 0柱 (4 .6× 1 5 0 mm)上进行逆相 HPLC分析。非单峰组分再进行 HPLC凝胶过滤柱TSKgel Toyopearl HW-40 Fine(4× 2 5 0 mm)层析 ,层析峰组分再进行 HPLC逆相分析。　结果　眼镜王蛇毒经HPLC离子交换柱层析获得了 1 6个蛋白组分 ,其中有 5个组分经逆相 HPLC分析单一组分 ;另外的复合性组分再进行 HPLC凝胶过滤柱层析后又得到 5个单峰蛋白组分。　结论　HPLC离子交换柱层析对分离蛇毒蛋白很有实用价值 ,特别是蛇毒样品量少的情况下 (1 0 ug)也能较好分离。还具有分离时间短 (1 h左右 ) ,无须低温条件等优点。HPLC凝胶过滤柱层析可进一步使蛋白组分得到提纯     

泛肽、核糖体蛋白及泛肽-核糖体蛋白S27a与肿瘤的关系

泛肽-核糖体蛋白S27a(Ubiquitin-ribosomal protein S27a,UBRS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白,N端为泛肽,C端由含C2-C2型锌指结构域的高度保守核糖体蛋白S27a构成。在真核细胞中表达时,被酶解成泛肽和核糖体蛋白。该多功能核糖体蛋白在各种活性增殖细胞和瘤组织中高度表达,在多种类型的肿瘤细胞中,该基因的过量表达是一个典型特征。本实验室对该蛋白在家蚕中的作了初步研究,也发现RPS27a在活性增殖细胞中表达量很高。大多数核糖体蛋白的功能还没有完全探明,它们不仅仅在组装成核糖体时起作用,往往还有核糖体外的功能。回顾了最近几年有关该融合蛋白以及与它相关的泛肽途径、核糖体蛋白与肿瘤之间的关系。通过对它们的研究,有可能预示肿瘤的发生和发展,并为肿瘤临床诊断提供依据,为恶性肿瘤的治疗提供靶点。     

Purification and characterization of a neurotoxin from the venom of Ophiophagus hannah (king cobra)

A neurotoxin, Oh9-1, from the venom of Ophiophagus hannah was isolated by a combination of ion-exchange chromatography and reverse phase HPLC. Amino acid sequence analysis revealed that Oh9-1 consists of 57 amino acids and eight cysteine residues. This protein was mainly constituted with beta-sheet as evidenced by CD spectrum. Oh9-1 inhibited carbachol-induced muscle contraction in an irreversible manner and the dose for achieving 50% inhibition was approximately fourfold that of alpha-bungarotoxin. Since the residues in alpha-neurotoxins closely involve in the binding with acetylcholine receptors are not highly conserved in this toxin molecule, Oh9-1 represents a novel type of neurotoxin structurally distinct from alpha-neurotoxins.