多杀菌素生物合成的分子机理与定向遗传改造策略

多杀菌素是由土壤放线菌刺糖多孢菌产生的次生代谢产物．主要活性物质为spinosyn A和spinosyn D,是一种新型的高效广谱大环内酯类杀虫剂,因其独特的杀虫机理而兼具生物农药的安全性与化学农药的快速性．简述了多杀菌素生物合成的分子机理,包括聚酮链的生物合成与修饰、NDP糖的合成、修饰与连接转移以及多杀菌素生物合成基因表达调控．通过对多杀菌素生物合成的限速步骤及相关基因的分析．探讨了提高多杀菌素产量与合成其新衍生物的定向遗传改造策略,并展望了其应用发展前景．     

亮氨酰氨肽酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及次级代谢产物合成的影响

【目的】构建亮氨酰氨肽酶基因(pep A)被阻断的刺糖多孢菌工程菌株,并鉴定该基因对刺糖多孢菌菌丝形态、生物量、菌体全蛋白表达水平及产多杀菌素能力的影响,探究该基因调控多杀菌素合成的可能机制。【方法】利用PCR扩增刺糖多孢菌中的pep A基因同源片段,经酶切连接技术构建敲除载体p OJ260-pep A;通过接合转移和单交换同源重组将该载体整合至刺糖多孢菌染色体中,获得工程菌株S.sp-△pep A;利用培养特征、形态学、高效液相色谱、SDS-PAGE等方法对菌株进行研究分析。【结果】工程菌株S.sp-△pep A菌丝片段化程度加剧,生长态势被延缓且生物量降低,但有效促进了多杀菌素的生物合成。阻断亮氨酰胺肽酶基因的表达使刺糖多孢菌菌体全蛋白表达情况发生明显改变,找到表达水平显著上调的差异蛋白核糖体蛋白亚基和醛基脱氢酶,核糖体蛋白亚基通过影响蛋白质代谢对菌体生长产生影响;醛基脱氢酶则可与乙醇脱氢酶、乙酰辅酶A的合成酶相互作用影响辅酶A合成,而辅酶A是合成多杀菌素的重要底物。【结论】在刺糖多孢菌合成多杀菌素的次级代谢过程中,pep A基因作为负调控因子发挥作用。     

增加糖基合成酶基因拷贝数对多杀菌素发酵单位的影响

多杀菌素是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa SIPI—A.2090)产生的重要农用抗生素,其生物合成途径已被阐明。NDP-葡萄糖合成酶(gtt)与葡萄糖脱氢酶(gdh)是多杀菌素生物合成途径中的限速酶。从SIPI-A.2090克隆gtt及gdh基因,并构建了表达这两个基因的整合型质粒,转入产多杀菌素刺糖多孢菌,发酵并验证其基因型。结果表明,阳性突变株SIPI—M.2092的多杀菌素发酵单位比出发菌株提高了173%,增加gtt和gdh基因拷贝数可以有效提高多杀菌素的发酵单位。     

多杀菌素生物合成途径及改造策略

多杀菌素是一类由刺糖多孢菌产生的新型大环内酯类化合物,是绿色农用抗生素的杰出代表。本文简要总结了多杀菌素生物合成过程,并对其生物合成调控的关键位点进行了分析,提出用合成生物学手段组装多杀菌素细胞工厂的策略。     

多杀菌素生物合成的研究进展北大核心CSCD

多杀菌素是在刺糖多胞菌发酵液中提取的一种大环内酯类生物杀虫剂,它对靶标昆虫具有独特的快速触杀和摄食毒性,兼具化学农药的速效性和生物农药的安全性,具有低残留、快速降解等优点。本文介绍了多杀菌素的生物合成途径和体外合成方法,对随机诱变、代谢工程定向改造等刺糖多孢菌工业菌株育种方法进行了介绍,对多杀菌素在异源宿主中的合成进行了讨论。     

多杀菌素生物合成基因簇启动子探测和转录时序

多杀菌素是对农业虫害防治及粮食仓储安全均具有重大意义的农用抗生素.为了深入揭示刺糖多孢菌合成多杀菌素的调控特点,首先通过建立基于报告基因的启动子探测技术,探测了多杀菌素生物合成基因簇的9个启动子活性.并进一步通过荧光定量PCR,分析了这9个基因和不在基因簇内的负责糖基前体供应和鼠李糖合成的4个基因的转录时序,结果表明多杀菌素生物合成基因簇内的9个基因在菌体生长进入稳定期时有较高的转录,这和发酵液中此时开始大量积累多杀菌素一致;同时还发现,簇外的4个与糖基供应相关的基因和基因簇内基因的转录时序不同,它们在菌体生长对数期有较高的转录活性,这暗示多杀菌素聚酮链的合成速率和参与后修饰的糖基底物供应的最优化匹配有可能是提高生物合成多杀菌素的前提和关键.     

刺糖多孢菌中铵载体蛋白基因amtS的克隆及功能研究

目的:铵离子是细胞内合成各种核酸、氨基酸和辅助因子等含氮化合物的重要原料之一。微生物细胞膜上的铵载体蛋白介导了铵离子的转运。通过异源表达刺糖多孢菌中铵载体蛋白基因,研究其对链霉菌产孢能力和次级代谢产物产量的影响。方法:从刺糖多孢菌S04-41菌株中克隆铵载体蛋白基因amt S,通过接合转移导入天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌TK24中,分析比较amt S基因的异源表达对其产孢能力和次级代谢产物产量的影响。结果:天蓝色链霉菌重组菌株M145/p MF-amt S和变铅青链霉菌重组菌株TK24/p MF-amt S中放线紫红素的产量分别提高了2.85倍和30.02倍。结论:刺糖多孢菌中的铵载体蛋白能够提高链霉菌中次生代谢产物的产量,为进一步研究该基因的功能与对刺糖多孢菌中多杀菌素合成的作用奠定了重要基础。     

透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成

为解决刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高密度深层培养过程中的供氧不足问题, 促进多杀菌素的生物合成, 采用重叠PCR 技术将透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)血红蛋白基因(vgb)可读框(ORF)置于红霉素抗性基因启动子(P_ermE)之下, 并将其克隆到整合型载体pSET152 上, 构建成vgb 表达载体pSET152EVHB; 通过接合转移方式将其导入刺糖多孢菌SP06081 中, 利用载体上ΦC31 整合性位点通过位点特异性重组将vgb 定点整合到SP06081 菌株染色体上, 获得一株遗传性能稳定的重组菌株S078-1101; 重组工程菌的PCR 与Southern blotting 检测显示vgb 已整合到染色体上, 一氧化碳结合差光谱分析表明在S078-1101 工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb); 摇瓶发酵结果显示, 在正常溶氧与中度限氧状态下, vgb 的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成(P<0.01). 这说明vgb 在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能, 是一种有效的定向遗传改良手段.     

新型生物农药-多杀菌素

多杀菌素是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后的次级代谢产物,是一种新颖的大环内酯类抗生素,兼有生物农药的安全性和化学农药的速效性。本文主要就多杀菌素的研究历史、结构、理化性质、生物合成、作用机制、杀虫活性和非靶标生物毒性及降解途径进行了综述。     

刺糖多孢菌生产多杀菌素的研究进展

多杀菌素(spinosad)是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵产生的新型生物杀虫剂。多杀菌素由于具有生物农药的安全性,化学合成农药的速效性,以及对哺乳动物、昆虫天敌和环境安全等特点,已在多个国家获准使用。目前我国多杀菌素的研究尚处于实验室阶段,产量相对较低,尚不具备工业化生产的条件。对多杀菌素的结构、生物合成途径、发酵培养基优化、高产菌株的选育及其衍生物等进行了综述。     

Rhamnose Biosynthesis Pathway Supplies Precursors for Primary and Secondary Metabolism in Saccharopolyspora spinosa

Rhamnose is an essential component of the insect control agent spinosad. However, the genes coding for the four enzymes involved in rhamnose biosynthesis in Saccharopolyspora spinosa are located in three different regions of the genome, all unlinked to the cluster of other genes that are required for spinosyn biosynthesis. Disruption of any of the rhamnose genes resulted in mutants with highly fragmented mycelia that could survive only in media supplemented with an osmotic stabilizer. It appears that this single set of genes provides rhamnose for cell wall synthesis as well as for secondary metabolite production. Duplicating the first two genes of the pathway caused a significant improvement in the yield of spinosyn fermentation products.     

Genome sequence of the Spinosyns-producing bacterium Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395

Saccharopolyspora spinosa is a Gram-positive bacterium that produces spinosad, a well-known biodegradable insecticide that is used for agricultural pest control and has an excellent environmental and mammalian toxicological profile. Here, we present the first draft genome sequence of the type strain Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, which consists of 22 scaffolds.     

基于核糖体工程理论的常压室温等离子体诱变筛选多杀菌素高产菌

利用核糖体工程理论,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变对刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行诱变筛选。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株为出发菌株,对其进行ARTP诱变,选取三个不同致死率的照射时间,将孢子悬液混合,以增加抗性筛选几率。然后基于核糖体工程技术理论对混合孢子悬液进行初筛,最终筛选出了1株多杀菌素高产菌Sg200Rif110St40Er90-028。该菌株同时具有磺胺胍、利福平、链霉素、红霉素的多重抗性,摇瓶发酵试验表明,发酵7d后多杀菌素浓度可达到1 516.93 mg/L,较出发菌株QYLZ 88912的产量610.75 mg/L提高了148.37%,且遗传性稳定。以得到的高产菌Sg200Rif110St40Er90-028作为出发菌株,对发酵培养基进行响应面优化实验,优化后的培养基(g/L):葡萄糖46.97、麦芽糊精35、酵母粉40.36、水浸棉籽粉32.88、碳酸钙3,多杀菌素的产量为2 361.81 mg/L,比出发菌株的产量提高了286.71%。     

多杀菌素生产菌种复壮方法及其效应的研究

用分离纯化复壮、淘汰法复壮及虫体复壮三种复壮方法对一株多杀菌素生产能力已经衰退的刺糖多孢菌进行复壮研究。结果显示：淘汰法复壮可显著提高菌株的杀虫毒力及多杀菌素的产量。通过红霉素抗性复壮筛选得到菌株杀虫死亡率达到100％,多杀菌素相对效价达1058．83％;通过NaCl抗性复壮筛选得到一菌株杀虫死亡率达到95％,多杀菌素相对效价达825．80％,因此淘汰法可作为有效的复壮方法。     

响应面法优化多杀菌素发酵培养基的研究

采用响应面分析方法,对刺糖多孢茵（Saccharopolyspora spinosa）H-2产多杀菌素的发酵培养基进行优化研究。运用单因子试验筛选出葡萄糖和棉籽粉为最适碳源和氮源,通过Plack—ett—Burman设计试验,对影响发酵培养基的8个相关因子进行评估并筛选出具有显著效应的4个因子：葡萄糖、棉籽粉、黄豆饼粉及玉米浆。通过最陡爬坡实验逼近以上4个因子的最大响应区域后,采用Box-Behnken响应面分析法,确定发酵产多杀菌素最佳培养基为葡萄糖64．5g,麦芽糖20g,玉米浆2g,大豆油40g,棉籽粉25g,黄豆饼粉2．4g,蛋白胨25g,CaCO35g,定容至1L,pH7．0。培养基优化后多杀菌素产量由278．1mg／L提高到508．7mg／L,比初始多杀茵素产量提高了1．83倍。