顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基的合成及自旋标记的血清白蛋白

本文报道制备顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基纯品的方法。本方法为Hamilton-McConnell 法的改进。在温和条件下,该化合物以共价键形式自旋标记到血清白蛋白的硫氢基和氨基等活性基团上。为利用自旋标记顺磁共振技术研究蛋白质分子的构象,提供了必要前提。经顺丁烯二酰亚胺氮氧自由基自旋标记的牛和羊血清白蛋白,由于标记位点和标记物所处的周围环境不同,给出了两类ESR 波谱:即强固定化作用型和弱固定化作用型。用0.5mMHgCl_2预处理牛血清白蛋白,阻断其硫氢基以后再自旋标记,仅给出弱固定化型波谱。从而进一步证明强固定化作用型波谱主要来自标记在蛋白质深层中的硫氢基;弱固定化作用型波谱则来自标记在靠近蛋白质表层的非硫氢基团上。通过对羊血清白蛋白自旋标记以后,再用8M尿素破坏其氢键的试验,发现原样品中强固定化型的谱线消失,仅剩下三条弱固定化型谱线。表明自旋标记物对蛋白质构象变化的反应是十分灵敏的。文中,对两类ESR 波谱用自旋哈密尔顿理论进行了描述。     

类脂氮氧自由基的合成及自旋标记膜

本文报道用索氏提取器代替Dean-stark肼合成了软脂酸噁唑氮氧自由基(Ⅰ)和一种至今未见报道的黄体酮噁唑氮氧自由基(Ⅱ)的方法,缩短了反应时间,提高了产率,产物经鉴定完全合格。将上述探针(Ⅰ)和(Ⅱ)分别自旋标记到脂质体膜和中国地鼠肺细胞膜(包括正常的和癌变的)以后,它们在膜中的位置和取向虽然不同,但给出的ESR波谱都能灵敏地反映介质的微观粘度、结构差异和分子运动等信息。其中我们发现低场峰的两种波谱组分[h_(a)]和[h_(1)]之间的比率有明显的规律性变化,其各向异性运动比值(M)与旋转相关时间(τ_0)有一定的线性关系。为此,我们提出了一个可反映类脂探针在膜中各向异性运动的简便经验式: M=h_(a)/h_(a) h_(1)。     

类脂氮氧自由基的合成及自旋标记膜

本文报道用索氏提取器代替Dean-stark肼合成了软脂酸噁唑氮氧自由基(Ⅰ)和一种至今未见报道的黄体酮嗯唑氮氧自由基(Ⅱ)的方法,缩短了反应时间,提高了产率,产物经鉴定完全合格。将上述探针(Ⅰ)和(Ⅱ)分别自旋标记到脂质体膜和中国地鼠肺细胞膜(包括正常的和癌变的)以后,它们在膜中的位置和取向虽然不同,但给出的ESR波谱都能灵敏地反映介质的微观粘度、结构差异和分子运动等信息。其中我们发现低场峰的两种波谱组分[h_((a))]和[h_((1))]之间的比率有明显的规律性变化,其各向异性运动比值(M)与旋转相关时间(τ_c)有一定的线性关系。为此,我们提出了一个可反映类脂探针在膜中各向异性运动的简便经验式: M=h_((a))/(h_((a)) h_((1)))。     

用马来酰亚胺自旋标记研究库存血红细胞膜蛋白质构象

用两种马来酰亚胺自旋标记物—马来酰亚胺Ⅰ和马来酰亚胺Ⅴ研究了红细胞膜蛋白质构象及巯基结合位点性质在ACD-B方库存血保存期间的动态变化。结果发现,在35天的血液保存期间,马来酰亚胺Ⅰ所标记红细胞膜的S/w值很快下降到一低水平,而马来酰亚胺Ⅴ所标记红细胞膜的旋转相关时间则呈现迅速下降后缓慢升高的双相性变化。作者结合膜蛋白构象及其周围微观环境进行了讨论。     

用马来酰亚胺自旋标记研究库存血红细胞膜蛋白质构象

用两种马来酰亚胺自旋标记物—马来酰亚胺Ⅰ和马来酰亚胺Ⅴ研究了红细胞膜蛋白质构象及巯基结合位点性质在ACD-B方库存血保存期间的动态变化。结果发现,在35天的血液保存期间,马来酰亚胺Ⅰ所标记红细胞膜的S/w值很快下降到一低水平,而马来酰亚胺Ⅴ所标记红细胞膜的旋转相关时间则呈现迅速下降后缓慢升高的双相性变化。作者结合膜蛋白构象及其周围微观环境进行了讨论。     

咪唑类氮氧自由基的合成及其DPPH清除能力的研究

目的:合成8种新型咪唑类氮氧自由基(4a~4h),并探讨其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)的清除作用。方法:本文以2-硝基丙烷为原料,经烷基化、还原、缩合及氧化反应等步骤,合成8种新型咪唑类氮氧自由基(4a~4h)。将4a~4h分别与DPPH作用,使用紫外-可见分光光度法测定其中DPPH的浓度,考察4a~4h对DPPH自由基的清除作用,以四甲基哌啶氮氧自由基(Tempol)作为阳性对照。结果:合成中间体及终产物经~1H NMR、HRMS、EPR等光谱数据确证了结构。通过DPPH自由基清除实验,结果显示所合成的8种新型咪唑类氮氧自由基对DPPH均有清除作用。结论:合成了新型咪唑类氮氧自由基,并对其合成方法进行了重要改进。在对DPPH自由基清除能力方面,8种化合物在一定浓度范围(0.01μmol/mL-2.4μmol/mL)内,清除作用与浓度成依赖性增长关系。其中,4b与Tempol相当,4a优于阳性对照Tempol,具有进一步开发研究的潜在价值。     

胸腺肽α1活性片段和其自旋标记衍生物的合成及免疫活性研究

报道了胸腺肽α１活性片段Ｔｈｙｍｏｓｉｎα１ＯＨ和其自旋标记衍生物的合成及对实验动物免疫功能的影响。实验结果表明人工合成胸腺肽α１活性片段及其自旋标记生物具有显著的免疫促进活性。     

胸腺肽α_1活性片段和其自旋标记衍生物的合成及免疫活性研究

报道了胸腺肽α_１活性片段Ｔｈｙｍｏｓｉｎα_１［Ｌｙｓ（２３）］（２３－２７）ＯＨ和其自旋标记衍生物的合成及对实验动物免疫功能的影响。其氨基酸序列分别为Ｈ_２Ｎ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－ＯＨ,用Ｔｈｙα_１［Ｌｙｓ~（２３）］表示,修饰物为Ｇｌｕ－ＯＨ）,用Ｔｈｙα_１［Ｌｙｓ~（２３）］·Ｒ表示。ＨＰＬＣ测得该肽的纯度在９０％以上,ＥＳＲ谱测定自旋标记衍生物给出氮氧自由基信号,氨基酸组成与预期值相符。实验小鼠腹腔连续注射剂量为０．１、１、１０、１００和１０００μｇ／ｋｇ的该肽１０天后,发现腹腔巨噬细胞吞噬功能、ＥＲＦＣ阳性率及血清溶血素含量明显升高,且最佳剂量在０．１－１０μｇ／ｋｇ范围。实验结果表明人工合成胸腺肽α_１活性片段及其自旋标记衍生物具有显著的免疫促进活性。     

植物中从二酰甘油到三酰甘油的两条合成新途径

过去认为植物中只有一条从二酰甘油到三酰甘油的合成途径。近年来,在一些植物体内又发现了从二酰甘油到三酰甘油合成的两条新途径。该文介绍这两条新途径及其意义。     

旋毛虫病鼠心肌及血清氧自由基变化的实验观察

观察小鼠感染旋毛虫后不同时期的心肌及血清中NOS、CAT、MDA及GSH-PX 4个检测指标的变化,以期从发病学角度分析氧化酶类在旋毛虫病的发生发展中所起的作用。结果显示：小鼠心肌中的NOS、CAT、MDA和GSH-PX 4个检测指标在感染旋毛虫后的不同时期（7-28d)呈现出明显不同的变化。心肌及血液中的MDA在感染过程中一直维持较高水平,而GSH-PX及CAT含量则显著减少。实验结果提示：旋毛虫可诱发氧自由基对心肌产生氧化损伤、氧化代谢产物的堆积及抗氧化能力的改变,这些因素可能是旋毛虫性心肌炎的形成原因。     

氮氧自由基自旋探针R1在特定空间位点上对bacteriorhodopsin产生颜色调谐效应的机理分析

蛋白质结构研究中的氮氧自由基自旋探针R1,在特定的空间位置上会对bacteriorhodopsin的结构与功能产生影响。该文作者发现:将bacteriorhodopsin中远离视黄醛的第192位Gly替换为自旋探针R1后,产生了显著的颜色调谐,最大吸收峰有28nm的蓝移。但用R1替换Gly192邻近的Gly195和Ala196,未产生颜色调谐效应;替换螺旋E末端的Val130和Tyr131,以及螺旋B末端的Leu62,均无颜色调谐。进一步表征bacteriorhodopsin光循环中间体O和M的衰减过程发现:R1替换前,Gly192Cys(+)的O态衰减寿命约为847.7ms;但替换后,其衰减显著加快至308.2ms。M态的衰减寿命在R1替换后反而显著延长,尤其是慢组分Ms从24.8ms延长至83.6ms。Gly192R1的顺磁共振信号揭示:该位置上的R1处于低运动性状态,表明R1可能与局部环境的结构组分发生了直接作用。晶体结构分析发现:R1可能直接与质子传递通道中的三体水分子作用。由于三体水分子通过长程的氢键网络与视黄醛活性中心相连,并且参与质子在bacteriorhodopsin中的传递,因此自旋探针R1...     

牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

肝胆显像螯合物—氮基三乙酸单酰苯胺及其类似物的合成

本课题合成四个氮基三乙酸单酰苯胺(IDA)类及其类似物肝胆显像螯合物。(1)用家兔做了肝胆显像扫描实验,其显像效果较好。(2)～(3)为未见报道的化合物。     

力复霉素前体甲基丙二酰CoA合成途径的研究

力复霉素合成的碳前体之一(2R)—甲基丙二酰CoA至少可以有三条酶学合成途径。三条途径中的关键酶分别为甲基丙二酰CoA转羧基酶、丙二酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶和甲基丙二酰CoA消旋酶。通过比较各个酶活性的时间进程和力复霉素合成时间的相关性,以及各个酶的底物亲合力,对它们在地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)甲基丙二酰CoA合成中的贡献作了排序,发现甲基丙二酰CoA变位酶途径是主要负责酶系。但是各个途径的贡献排序并不是固定不变的,能受到环境因素的调控,丙酸盐的加入将抑制甲基丙二酰CoA变位酶活力,而使得甲基丙二酰CoA转羧基酶成为主要酶系。甲基丙二酰CoA合成途径的多样性有助于细胞对环境变化的灵活反应。此外,对各个酶的调控特性也进行了研究。     

胆碱摄取及磷脂酰胆碱合成的调节研究

木文研究了多种氨基酸、乙醇胺和甲基乙醇胺对细胞摄取胆碱和合成磷脂酰胆碱（ＰＣ）的影响,发现多种氨基酸非竞争性地抑制细胞摄取胆碱。含胆碱代谢物的分析显示胆碱转变成ＣＤＰ－胆碱,随之形成ＰＣ均不受氨基酸影响。乙醇胺竞争性地抑制胆碱摄取,且存在剂量依赖关系。乙醇胺能明显抑制胆碱激酶活性,但细胞内胆碱和磷酸胆碱的代谢池并不改变,提示乙醇胺不影响胆碱转变成磷酸胆碱。根据ＣＤＰ－胆碱和ＰＣ的比放射性分布,乙醇胺也不影响ＰＣ的生物合成。甲基乙醇胺抑制胆碱摄入的程度强于乙醇胺,并抑制胆碱激酶和ＣＴＰ：磷酸胆碱胞苷转移酶活性,含胆碱代谢物以ＣＤＰ－胆碱下降最显著;提示甲基乙醇胺不仅抑制胆碱摄入而且还干扰了ＣＤＰ－胆碱通路。     

新型氮杂多肽酰肼类衍生物的设计、合成和抗肿瘤活性研究

目的:新型氮杂多肽酰肼类衍生物的设计和合成及其抗肿瘤活性研究。方法:以脯氨酸甲酯盐酸盐为原料,通过与苄氧羰基丙氨酸反应,在肼中肼解,得到所需中间体,进而与富马酸单酯反应得到目标化合物;和溴乙酸叔丁酯反应,三氟乙酸中脱去叔丁氧基,再与取代胺或氨水反应得到目标化合物。用MTT法测试合成的氮杂多肽酰肼类衍生物对肿瘤细胞的抑制活性。结果:合成了10个氮杂多肽酰肼类衍生物,其中有6个化合物对肿瘤细胞表现出抑制活性。结论:初步建立了氮杂多肽酰肼类衍生物的合成方法及其对肿瘤细胞抑制活性的构效关系。     

重组人血清白蛋白抗体检测方法的建立及确证

目的：建立一种高灵敏度、高特异性、操作简单快捷、通量高的重组人血清白蛋白（rHSA）抗体检测方法。方法：采用桥连ELISA法,即将rHSA包被于96孔板,加入待测血样及阳性对照,用辣根过氧化物酶标记的rHSA检测,显色读取D_450nm/D_570nm值：用此方法确定临界值、方法灵敏度、精密度、血药浓度对检测方法的影响,再以免疫清除法进行确证。结果：通过桥连ELISA法确定临界值为0．0492,方法灵敏度为352ng／mL,方法板间、板内精密度均小于20％,且血药中的rHSA浓度为20μg／mL时不影响抗体的检测;经免疫清除法可将假阳性样本排除,从而提高了方法的特异性．结论：建立的方法可以准确、快速地检测出rHSA的特异性抗体。