HMG非组蛋白在基因表达调节中的作用——Ⅱ.正常大鼠肝和大鼠移植性BERH-2肝癌HMG非组蛋白比较研究

本实验通过5%过氯酸抽提、丙酮分级分离以及CM-Sephadex离子交换层析等步骤分别从正常大鼠肝和大鼠移植性肝癌(BERH-2)细胞核中获得了HMG蛋白,并且比较了它们的电泳和层析行为以及生物学作用,发现正常鼠肝和肝癌HMG没有明显的质的差别。比较了正常大鼠肝细胞核和BERH-2肝癌细胞核体外转录活性,并比较了DNA酶Ⅰ消化这两种细胞核的动力学和有限消化时释放出来的HMG和组蛋白H_1相对量的变化。发现肝癌细胞核转录活性明显高于正常大鼠肝细胞核;肝癌细胞核对DNA酶Ⅰ消化的敏感性大于正常肝细胞核;肝癌细胞核在DNA酶Ⅰ有限消化时HMG的释放较正常大鼠肝细胞核多。实验结果说明,在肝癌的细胞中HMG与正常肝细胞的HMG可能没有明显的质的差别,但与活性核小体结合的HMG量有所增加。这可能是肝癌染色质结构的改变,基因转录失常原因之一。     

HMG_(17)非组蛋白与转录活性基因的关系

 用核内蛋白质与经0.4mol/L NaCL抽提后的细胞核重组,以DNA酶I消化法为测定活性基因的指标,观察猪胸腺HMG_(17)非组蛋白对细胞核中活性基因的影响。结果显示:猪胸腺HMG_(17)使细胞核对DNA酶I作用的敏感性增加,因此认为HMG17为使细胞核胞核中基因呈较大活性的重要因素。     

三种提取HMG染色体非组蛋白方法的比较

非组蛋白是在染色体中组蛋白以外的蛋白 质。它除了含有基因的调控蛋白外,还具有许 多与核酸代谢有关的酶和结构蛋白。非组蛋白 从染色体复合物上分离下来后,很容易聚集在 一起,也很容易被蛋白水解酶降解。所以,它们 很难在溶液中保持原状〔31。目前,非组蛋白中能 够较好地分离、纯化,并对其生物学性质及结构 功能加以详细研究的是一组称为高泳动因子的 染色体非组蛋白,简称HMG染色体非组蛋白。 HMG蛋白质分子量较低（MW < 30, 000),可 以用稀盐溶液或高氯酸从细胞核提取,并能溶 于2沁三氯乙酸溶液中。HMG蛋白质主要含 有4种主要成份： HMG HMG2, HMGl4和 HMG,,, HMG蛋白质与组蛋白有相似之处,它 们的碱性氨基酸残基的含量很高（25-30多）; 与组蛋白不同的是它们的酸性氨基酸残基的含 量也很高（20-30务）。碱性和酸性氨基酸的 含量加在一起占HMG蛋白质氨基酸含量的一 半左右^[5,11,13]     

组蛋白与hAMFR基因启动子的结合对体外转录活性的影响

采用从鸡血红细胞中分离纯化的组蛋白,从ＨｅＬａ细胞核中萃取的含有ＲＮＡ聚合酶Ⅱ和多种Ⅱ类基因转录因子的可溶性抽提物,以及从非洲爪蟾卵细胞核中撮以的萃取物热处理物上清用于核小体构建,以含有人自泌移动因子受体基因启动子序列的ＤＮＡ片段为模板进行体外转录实验,结果表明,组蛋白和转录因子在ｈＡＭＦＲ基因启动子序列上的竞争性结合对转录活性具有重要的影响作用,在启动子区域预先构建的核小体能够抑制转录活性;     

HMG蛋白质与人β-类珠蛋白基因5′上游LCR内HS2core DNA相互作用

HMG蛋白质是真核细胞核内一组含量丰富的非组蛋白,它们在染色质的结构与功能及基因表达调控过程中均起着重要作用.应用体外核小体重组技术和凝胶电泳阻抑法,分析了HMG蛋白质与人β-类珠蛋白基因5′上游LCR内的DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列(HS2core sequence,-10681～-10970 bp)之间的作用模式.实验结果表明,HMG蛋白质(1/2)能与HS2core DNA序列相结合,但HMG蛋白质(14/17)不能与它结合.将HS2core DNA在体外组装成核小体之后,HMG蛋白质(1/2)则不能与组装成核小体形式的HS2core DNA序列结合,而HMG蛋白质(14/17)却能与它结合.结果提示当HS2core DNA序列处于不同状态时,它与HMG蛋白质的结合模式是不同的,HMG蛋白质可能通过这一途径积极参与了人体β-类珠蛋白基因的表达调控.     

组蛋白乙酰化／去乙酰化作用与真核基因转录调控

核小体组蛋白的翻译后修饰是真核基因转录调控中的关键步骤。对于组蛋白的这类修饰方式 ,近年来研究最为活跃的是组蛋白Ｎ末端区域保守的Ｌｙｓ上ε ＮＨ 3 的乙酰化作用。随着各种组蛋白乙酰化酶 /去乙酰化酶被克隆、鉴定 ,组蛋白乙酰化 /去乙酰化作用与真核基因转录调控之间的关系也开始逐步得以阐明。1 .真核转录相关的组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶1 .1　组蛋白乙酰化酶 (ｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓ ｆｅｒａｓｅ ,ＨＡＴ)　　核小体组蛋白中Ｎ末端区域上保守的Ｌｙｓ的乙酰化是染色质具有转录活性的标志之一。在组蛋白…     

盐离子作用下组蛋白变体H2A.Z增强核小体结构的稳定性

真核生物染色质的基本结构组成单元是核小体,基因组DNA被压缩在染色质中,核小体的存在通常会抑制转录、复制、修复和重组等发生在DNA模板上的生物学过程。组蛋白变体H2A.Z可以调控染色质结构进而影响基因的转录过程,但其详细的调控机制仍未研究清楚。为了比较含有组蛋白变体H2A.Z的核小体和常规核小体在盐离子作用下的稳定性差异,本文采用Förster共振能量转移的方法检测氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙、氯化镁等离子对核小体的解聚影响。实验对Widom 601 DNA序列进行双荧光Cy3和Cy5标记,通过荧光信号值的变化来反映核小体的解聚变化。Förster共振能量转移检测结果显示:在氯化钠、氯化钾、氯化锰、氯化钙和氯化镁作用下,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体解聚速度相比于常规核小体要慢,且氯化钙、氯化锰和氯化镁的影响更明显。电泳分析结果表明,在75℃条件下含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的解聚速率明显低于常规核小体。采用荧光热漂移检测(fluorescence thermal shift analysis , FTS)进一步分析含有组蛋白变体H2A.Z核小体的稳定性,发现两类核小体的荧光信号均呈现2个明显的增长期,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的第1个荧光信号增速期所对应的温度明显高于常规核小体,表明核小体中H2A.Z/H2B二聚体的解聚变性温度要高于常规的H2A/H2B二聚体,含有组蛋白变体H2A.Z核小体的热稳定性高。研究结果均表明,含有组蛋白变体H2A.Z的核小体的结构比常规核小体的结构稳定。     

组蛋白变体及组蛋白替换

组蛋白作为核小体的基本组分,是染色质的结构和功能必需的。对于不同状态的染色质,核小体中会组装入相应的组蛋白变体,并且各种组蛋白变体的尾部也能发生多种修饰。这些变体通过改变核小体的空间构象和稳定性,决定基因转录的激活或沉默,DNA的修复,染色体的异染色化等。在组蛋白替换过程中,组蛋白变体是通过相应的染色质重构复合物组装入核小体,不同的变体有着不同的组装途径。对组蛋白变体的研究是近年来表观遗传学新的研究热点,也是对“组蛋白密码”的新的诠释。并且,组蛋白替换揭示了DNA-组蛋白相互作用变化的一种新的机制。

     

体外组装含有组蛋白变体H2A.Z及H3.3的核小体

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位,组蛋白变体H2A.Z及H3.3对染色质结构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制,体外重构含有H2A.Z及H3.3的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法之一。实验表达纯化了6种组蛋白,在复性的过程中装配了含有H2A.Z和H3.3的组蛋白八聚体。基于DNA序列10bp周期性及序列模体设计了3条易于形成核小体的DNA序列,通过PCR大量扩增的方法,回收了标记Cy3荧光分子的目的 DNA序列。采用盐透析法体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构,利用荧光标记、EB染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现,设计的3条DNA序列可以有效地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构,而且随着组蛋白八聚体与DNA比例的增加,核小体的形成效率显著提高;采用Cy3荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。     

技术与方法体外组装含有组蛋白变体H2A.Z及H3.3的核小体

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位,组蛋白变体H2A.Z及H3.3对染色质结构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制,体外重构含有H2A.Z及H3.3的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法之一。实验表达纯化了6种组蛋白,在复性的过程中装配了含有H2A.Z和H3.3的组蛋白八聚体。基于DNA序列10bp周期性及序列模体设计了3条易于形成核小体的DNA序列,通过PCR大量扩增的方法,回收了标记Cy3荧光分子的目的DNA序列。采用盐透析法体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构,利用荧光标记、EB染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现,设计的3条DNA序列可以有效地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构,而且随着组蛋白八聚体与DNA比例的增加,核小体的形成效率显著提高;采用Cy3荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。     

RNA促进小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性

同样的基因在不同的分化细胞中表达不同,基因的选择性表达问题涉及分化和衰老的本质。转录基因对DNaseⅠ(DNA酶Ⅰ)消化敏感,本文研究了RNA对小鼠重组染色质白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性的影响。分离BALB/c小鼠脑细胞核,加入终浓度为2mol/L的NaCl破坏核小体结构,加入不同量、不同来源的RNA,装透析袋,逐渐降低离子强度进行染色质重组。重组染色质中加入DNaseⅠ消化DNA,PCR扩增白蛋白基因的外显子1到外显子2约1200bp区段,PAGE电泳后,用银染色观察不同来源RNA促进DNaseⅠ对白蛋白基因的消化作用。不同组织来源（肝、肺、肾、脑）RNA对小鼠重组染色质中白蛋白基因DNaseⅠ消化敏感性均有促进作用,其中肝和肺RNA促进消化作用较强;酵母tRNA无显著促进消化作用;消化促进作用与RNA剂量有关。RNA能增加DNaseⅠ对白蛋白基因的消化敏感性且有组织（细胞）来源特异性。又委托丹麦Chemical R D 实验室合成2条与白蛋白基因互补的各23核苷酸的RNA,用其进行重组试验。结果表明,重组混合物中含有低至0.2μg/mL的RNA,即可以发挥显著的DNase I消化促进作用。     

衰老过程中鼠肝细胞核体外重组的转录活性

本文以０．３５ｍｏｌ／ＬＫＣｌ抽提不同年龄鼠肝细胞,将抽提后细胞核分别与抽提物、纯化的染色质高迁移率非组蛋白（ＨＭＧ）及组蛋白Ｈ１进行重组。结果发现,０．３５ｍｏｌ／ＬＫＣｌ抽提后老年鼠肝细胞与断乳鼠肝细胞核抽提物重组转录活性高于其与自身或青年鼠肝细胞核抽提液重组者。还发现高迁移率非组蛋白可提高抽提后鼠肝细胞核转录活性,对断乳鼠的作用最强;但不影响未经抽提的细胞核转录活性。相反,组蛋白Ｈ１则可抑制各年龄组鼠肝细胞核的转录活性。     

高迁移率族蛋白成员HMG20a/b的研究进展

高迁移率族(HMG)蛋白是一类广泛存在的非组蛋白型染色体蛋白,能通过诱导染色质结构的变化影响DNA表达。HMG20a和HMG20b是一对高度同源的HMG家族蛋白,均含有一个结构保守的HMG-box结构域和一个coiled-coil结构域,在生物体内广泛表达。HMG20a/b在细胞核内参与组蛋白去甲基酶复合物LSD1-Co REST的形成及一系列与细胞分裂分化相关的生理进程,如神经细胞核红细胞的分化、细胞质分裂以及EMT过程。研究发现,HMG20a/b一些功能的发挥是通过LSD1-Co REST复合物来实现的;在神经分化过程中,HMG20a、HMG20b具有相互拮抗的作用;而HMG20a促进EMT过程反映它很可能是一个促癌因子。本文对HMG20a/b的结构和体内分布及生物学功能进行综述。     

γ-射线对大鼠小肠粘膜上皮细胞RNA合成的影响及其机理的研究

本文观察了15戈瑞γ-射线全身照射后,大鼠小肠粘膜上皮细胞核体外转录活性,从染色质结合的RNA聚合酶和可溶性RNA聚合酶活性变化探讨辐射对核转录活性的抑制机理。实验结果表明:(1)照后2小时、8小时和24小时,核转录活性分别下降22.7％、20.8％和28.2％;(2)染色质结合的RNA聚合酶活性变化与细胞核转录活性变化基本平行,提示核转录活性降低与核内染色质损伤有关;(3)照后24小时,核分离的可溶性RNA聚合酶抑制58％,提示辐射至少部分是通过抑制RNA聚合酶而影响细胞核转录活性;(4)在细胞核和分离的RNA聚合酶都观察到RNA聚合酶Ⅱ抑制程度大于RNA聚合酶Ⅰ和酶Ⅲ,酶活性下降主要表现在RNA聚合酶Ⅱ提示不同类RNA聚合酶对辐射的敏感性不同,酶Ⅱ对辐射更敏感。     

组蛋白H3变体H3.3及其在细胞重编程中的作用

组蛋白是真核生物中一类进化上相对保守的蛋白质。由组蛋白八聚体及缠绕其上的DNA构成的核小体是真核生物染色质的基本组成单位。核小体使DNA保持固缩状态,既能维持基因组的稳定性,又能保证DNA序列可以正确地进行复制、转录、重组和修复。核小体调控细胞的生物过程除了通过组蛋白翻译后修饰,还可以通过组蛋白变体替换的方式进行。研究发现,组蛋白H3变体H3.3与常规组蛋白H3尽管仅有几个氨基酸的区别,但H3.3却能由特异的分子伴侣介导,整合进入染色质的特定区域,从而发挥不同的作用。同时,H3.3作为一种母源因子在正常受精和体细胞核移植等细胞重编程过程中也发挥着重要作用。本文总结了H3.3的结构特点和富集情况,探讨了特异的分子伴侣及其在细胞重编程中的作用,以期为提高体细胞重编程效率提供新思路,为体细胞重编程的应用奠定基础。     

三种提取HMG染色体非组蛋白方法的比较

非组蛋白是在染色体中组蛋白以外的蛋白质。它除了含有基因的调控蛋白外,还具有许多与核酸代谢有关的酶和结构蛋白。非组蛋白从染色体复合物上分离下来后,很容易聚集在一起,也很容易被蛋白水解酶降解。所以,它们很难在溶液中保持原状。目前,非组蛋白中能够较好地分离、纯化,并对其生物学性质及结构功能加以详细研究的是一组称为高泳动因子的染色体非组蛋白,简称HMG染色体非组蛋白。     

衰老过程中鼠肝细胞核体外重组的转录活性

本文以０．３５ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ抽提不同年龄鼠肝细胞,将抽提后细胞核分别与抽提物、纯化的染色质高迁移率非组蛋白（ＨＭＧ）及组蛋白Ｈ１进行重组。结果表现,０．３５ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ抽提后老年鼠肝细胞与断乳鼠肝细胞核抽提物重组转录活性高于其与自身或青年鼠肝细胞核抽提液重组者。还发现高迁移率非组蛋白可提高抽提后鼠肝细胞核转录活性,对断乳鼠的作用最强;但不影响未经抽提的细胞核转录活性。相反,组蛋白Ｈ１则可     

组蛋白修饰与基因调控

基因表达是一个受多因素调控的复杂过程,组蛋白是染色体基本结构－核小体中的重要组成部分,其N－末端氨基酸残基可发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚ADP糖基化等多种共价修饰作用,组蛋白的修饰可通过影响组蛋白与DNA双链的亲性,从而改变染色质的疏松或凝集状态,或通过影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因调控作用,组蛋白修饰对基因表达的调控有类似DNA遗传密码的调控作用。     

体外装配核小体过程组蛋白浓度依赖的动力学模型

为探索组蛋白浓度对核小体体外装配的影响,本研究表达纯化了4种组蛋白,通过控制实验反应体系中组蛋白的浓度,利用盐透析法在体外装配了核小体,检测分析了组蛋白浓度与核小体组装效率的关系。以此实验数据为基础,提出了核小体组装过程组蛋白浓度依赖性的动力学模型。实验结果发现,反应体系中组蛋白浓度与核小体生成量呈典型的线性关系。依据动力学理论模型,进行线性回归拟合,回归系数达到0.963;经计算601 DNA序列组装核小体的反应速率常数k为1.49×10^-5mL·h·μg^-1。CS1序列验证动力学模型的线性回归相关系数为0.989,反应速率常数为1.52×10^-5mL·h·μg^-1。该实验方法及动力学模型中反应速率常数k可用于评价相同长度的DNA序列组装核小体的能力、组蛋白与其突变体以及组蛋白变体之间形成核小体结构能力的差异。该动力学模型的建立为理解核小体装配、核小体定位、染色质结构等相关问题提供了理论指导。     

组蛋白乙酰化与真核基因的转录

在真核生物的染色质结构中,核小体核心组蛋白氨基末端可以被组蛋白乙酰基转移酶（ＨＡＴｓ）修饰。这种可逆乙酰化修饰作用可使染色质结构发生动态调整,从而影响基因的转录活性。