35S标记重组植物钙调素的制备方法

利用³⁵S标记的氨基酸混合物喂养工程菌,成功地制备了³⁵S标记的拟南芥钙调素亚型2（³⁵S-ACaM2）,对其纯度、放射活度、电泳行为及其灵敏性等进行了检测.结果表明从工程菌中制备的³⁵S-ACaM2纯度高、放射活度高、Ca²⁺与EGTA存在时的电泳行为与未标记的ACaM2相同,可作为一种高灵敏性的探针用于检测钙调素结合蛋白.     

Equilibration of [3H]glucosamine and [35S]sulfate with intracellular pools of UDP-N-acetylhexosamine and 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate (PAPS) in cultured fibroblasts

Nucleotides and sugar nucleotides were extracted from cultures of human fibroblasts with perchloric acid, separated by isotachophoresis, and quantified by uv absorption analysis at 254 nm. ATP (936 pmol/μg DNA) was, as expected, the dominating nucleotide pool. The energy charge was estimated to 0.9. The UDP-N-acetylhexosamine pool was also a very prominent compound (596 pmol/μg DNA). After incubation of fibroblasts with [³H]glucosamine, more than 95% of the acid-soluble radioactivity was found in the UDP-N-acetylhexosamine pool. Incubation with [³⁵S]sulfate resulted in the incorporation of [³⁵S]sulfate into 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulfate (PAPS). The latter could, however, only be measured as radioactivity, as the amount was too small to be quantified as total mass. Pulse-labeling of fibroblasts with [³⁵S]sulfate and [³H]glucosamine from 5 min to 16 h showed that [³⁵S]PAPS was equilibrated in less than 10 min, while [³H]glucosamine required a longer time, 2–4 h, to attain a steady state with UDP-N-acetylhexosamine. [¹⁴C]Glucose required approximately the same time as [³H]glucosamine to reach steady state with UDP-acetylhexosamine, which suggests that the reason for the long equilibration time is the slow turnover of this pool.     

亚热带季风常绿阔叶林树木年轮的13C/12C和空气CO2浓度变化

测定了亚热带季风常绿阔叶林的几种树木年轮的¹³C/¹²C比率(δ¹³C)。云南银柴的1962-1983年年轮δ¹³C平均为-28.53±0.84（n=5）,华润楠的1951-1984年年轮的δ¹³C为-28.46±0.53（n=6）。黄果厚壳桂的1951-1984年年轮的δ¹³C为-29.19±0.80（n=6）,木荷的1975-1984年年轮δ¹³C为-28.42±0.41（n=4）,δ¹³C数值偏离平均值逐年增大。计算空气CO₂浓度每年递增1.21μ1/L。     

13C标记代谢流分析中天然稳定性同位素修正矩阵构建方法及应用

稳定性同位素¹³C标记实验是分析细胞代谢流的一种重要手段,主要通过质谱检测胞内代谢物中¹³C标记的同位素分布,并作为胞内代谢流计算时的约束条件,进而通过代谢流分析算法得到相应代谢网络中的通量分布。然而在自然界中,并非只有C元素存在天然稳定性同位素¹³C,其他元素如O元素也有其天然稳定性同位素¹⁷O、¹⁸O等,这使得质谱方法所测得的同位素分布中会夹杂除¹³C标记之外的其他元素的同位素信息,特别是分子中含有较多其他元素的分子,这将导致很大的实验误差,因此需要在进行代谢流计算前进行质谱数据的矫正。本研究提出了一种基于Python语言的天然同位素修正矩阵的构建方法,用于修正同位素分布测量值中由于天然同位素分布引起的测定误差。文中提出的基本修正矩阵幂方法用于构建各元素修正矩阵,结构简单、易于编码实现,可直接应用于¹³C代谢流分析软件数据前处理。将该修正方法应用于¹³C标记的黑曲霉（Aspergillus niger）胞内代谢流分析,结果表明本研究提出的方法准确有效,为准确获取微生物胞内代谢流分析提供了可靠的数据修正方法。     

13CMFA过程中GC-MS分析菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度

基于13C标记的代谢通量分析(13CMFA)由于具有准确性和应用性已成为国际上代谢工程研究的热点,其中一个至关重要的问题就是分析菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。用含20%全标记葡萄糖（［U-13C］）和80%天然葡萄糖的合成培养基喂养维生素B12生产菌Pseudomonas denitrifican,然后在稳态条件下取20mg带13C标记菌体用1ml 6mol/L盐酸95℃水解24h得到带13C标记的菌体蛋白氨基酸;氨基酸经分离、浓缩、真空干燥、MBDSTFA衍生化后得到的TBDMS衍生物可以用气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析,最后分析质谱图得到15种菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。成功获得菌体蛋白氨基酸13C标记丰度信息的实验方法和样品处理技术,为13CMFA在国内进一步发展提供了参考意义。     

两个特用稻的营养供应水平与32P、14C分布和谷产量的关系

香稻(竹香粘)的分蘖数多,其分蘖期根系吸收³²P和³²P分布到分蘖,以高、中肥和高N,高K肥处理的为高;¹⁴C-葡萄糖同化物分布在分蘖比黑米稻(黑优粘)和常规稻“双桂36”的高,但灌浆期和黄熟期¹⁴C分布在稻穗较少.低肥处理的稻谷产量较高.而在高、中肥条件下结实率降低,实粒数减少,成穗率稍低,谷产量也比“黑优粘”和“双桂36”低. “黑优粘”在高肥、高N条件下的分蘖多,成穗率高、结实粒数也较多,稻谷产量比“竹香粘”高,在高、中肥、高 N高 P条件下,³²P分布于分蘖多,分蘖的¹⁴C分布则以高 N,高 K肥条件下的多;开花和灌浆用稻穗的¹⁴C分布皆以高 K肥水平的为高。“黑优粘”是耐肥和需钾肥品种,高肥、高K可提高其稻谷产量,但仍比“双桂36”低.     

λ[ 3H]DNA的制备和酶制剂中污染的核酸外切酶的检测

本文介绍一种简便制备λ[ ³H]DNA的方法。用该方法制备λ[ ³H]DNA,每升培养物可得10mg以上的产物。比放射性为6.75×10⁴cpm／μGλDNA,酸不溶的放射性产物达99%以上。用单链和天然的λ[ ³H]DNA作底物,能方便地检测出酶制剂中极微量的核酸外切酶Ⅰ与Ⅱ和Ⅲ的污染活性。     

集约化生产对农田土壤碳氮含量及δ13C和δ15N同位素丰度的影响

集约化生产下农田土壤碳、氮含量变化是衡量土壤肥力持久性的重要指标.对常规水稻-蚕豆轮作地、露地蔬菜地、3年塑料大棚地和10年以上塑料大棚地的土壤pH、电导率(EC)、土壤有机碳(SOC)和总氮(TN)含量及δ13C和δ15N同位素丰度进行测定,研究了集约化生产程度对土壤特性的影响.结果表明： 与水稻-蚕豆轮作地相比,露地蔬菜地、3年塑料大棚地和10年以上塑料大棚地0～20 cm耕层土壤pH分别降低1.1、0.8和0.7,而土壤EC分别是水稻-蚕豆轮作地的4.2、4.9和5.2倍;土壤碳、氮含量随塑料大棚地生产年限的增加总体上呈先增大后减小的趋势.与水稻-蚕豆轮作地相比,10年以上塑料大棚地0～20、20～40、40～60、60～80、80～100 cm土层的土壤SOC含量分别下降了54%、46%、60%、63%和59%,土壤TN含量分别下降了53%、53%、71%、82%和85%.农田集约化生产程度显著影响土壤SOC、TN含量和δ13C、δ15N丰度,土壤δ13C丰度与SOC含量呈显著负相关.土壤δ13C丰度可作为评价农田土壤碳循环受人为干扰强度的指标.     

栓皮栎叶片δ13C和δ15N的纬向趋势及其影响因子

以东亚广布种栓皮栎为例,通过对南北样带(26°-40° N)上7个群体的调查取样,并结合2个生活史阶段,探讨栓皮栎碳氮同位素比值随纬度环境的变异规律.结果表明: 在纬向梯度上,栓皮栎叶片δ¹³C和δ¹⁵N随纬度的增加分别呈现非线性的增加和下降趋势,且成年树叶片δ¹³C和δ¹⁵N均显著高于幼树;同时,树龄和纬度对叶片δ¹⁵N和δ¹³C均无显著交互作用,表明栓皮栎幼树和成年树纬向环境变化的响应较为一致.随机森林模型结果显示,栓皮栎叶片δ¹⁵N主要受土壤养分,如土壤有机质、磷和氮含量的影响,而叶片δ¹³C主要受水分因子,如空气相对湿度、降水量等的影响.     

等量分次施氮对冬枣15N和13C利用与分配特性的影响

以4年生盆栽冬枣为试材,采用¹³C、¹⁵N双标记示踪技术,在果实发育期研究了等氮量分次追施氮肥对冬枣植株¹⁵N和¹³C吸收、利用、积累和分配的影响.结果表明: 至果实采收期,冬枣各器官Ndff值(植株器官从肥料中吸收分配到的¹⁵N量对该器官全氮量的贡献率)随追氮次数的增多而显著增大.生殖器官(果实)和营养器官(叶片、枣吊、新生枣头枝和细根)的¹⁵N分配率以4次追氮处理最高,1次追氮处理最低,贮藏器官(主干、多年生枝和粗根)¹⁵N分配率的趋势相反;4次追氮处理¹⁵N利用率分别比1次和2次追氮处理高27.4%和15.5%.追氮次数越多,植株总氮量和¹⁵N吸收量越大;随时间的推移,1次追氮处理土壤¹⁵N丰度和总氮含量持续降低,2次追氮处理呈先升高后降低的趋势,4次追氮处理变化相对最为平稳,至处理后期显著高于其他处理;果实白熟至采收期,叶片叶绿素、氮含量和净光合速率均表现为4次追氮>2次追氮>1次追氮.不同处理¹³C同化物积累与分配不同.4次追氮处理¹³C固定总量分别是1次和2次追氮处理的1.1和1.2倍.增加追氮次数,促进了¹³C同化物向果实和贮藏器官的转移,而减少了向当年生营养器官的分配.综上,果实发育期4次追氮通过保证根层稳定、充足的氮素供应,提高了对氮素的吸收和利用,进而维持了较高的净光合速率,促进并优化了光合同化物的积累和分配,最有利于冬枣树体的生长及产量和品质的提高.     

氮水平对苹果叶片13C光合产物和15N向果实转移分配的影响

以6年生‘烟富3’/M26/平邑甜茶苹果为试材,采用C、N双标记技术,研究在果实膨大后期用不同尿素浓度水溶液(N 0%、0.6%、1.2%、1.8%、2.4%,分别用CK、N₁、N₂、N₃、N₄表示)涂抹果实周围20 cm范围内叶片对叶片¹³C同化能力及¹³C光合产物、¹⁵N向果实转移分配的影响.结果表明: 随着尿素浓度的增加,叶片的叶绿素含量、氮含量、光合速率、山梨醇和蔗糖含量、6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性及¹³C同化能力均先升高后降低,均以1.8%尿素涂抹处理最高,清水对照最低.¹³C自留量(自身叶片+自身新梢)以清水对照最高,为81.6%,1.8%尿素涂抹处理最低,为63.5%.向外输出的¹³C光合产物主要分布在标记果实,其次是未标记多年生枝,未标记叶片最低.果实¹³C吸收量随着尿素浓度增加呈先升高后降低趋势,以1.8%尿素涂抹处理最高(1.21 mg·g^-1),清水对照最低(0.51 mg·g^-1);果实¹⁵N吸收量随着尿素浓度增加呈持续升高趋势.表明尿素水溶液叶施可不同程度地提高叶片光合产物和氮素向果实转移分配的能力,以1.8%尿素涂抹处理叶片光合产物向果实转移分配能力最强,同时避免了过多的氮素向果实的输入.     

植物和土壤δ13C的分析误差校正与数据标准化

植物和土壤中稳定碳同位素(δ¹³C)可用于指示、示踪和整合碳循环关键过程与功能。双路和连续流气体稳定同位素比值质谱仪(IRMS)是δ¹³C的两种测试技术,其精度和准确度受分析误差和数据标准化方法影响。分析误差包括记忆效应、时间漂移和信号强度依赖性等。将测定序列按样品δ¹³C从低到高排列或延长气路冲洗时间消除或降低记忆效应;在测样序列中内插标准物质并建立测定时间与分析误差的函数关系校正时间漂移;信号强度依赖性应先校正样品空白效应,再校正仪器非线性响应。数据标准化包括标准物质和数据标准化方法选择。选择的标准物质δ¹³C应涵盖待测样品δ¹³C,且遵循同等处理原则;标准物质数量≥4或每个标准物质重复测定次数≥4;数据标准化体系应长期稳定,并添加监测标准物质。     

柴达木盆地白刺叶片δ13C与叶片和土壤养分指标的关系

在青海省柴达木盆地选择6个重要的唐古特白刺分布区域,通过测定不同白刺居群的叶片营养元素、土壤养分含量和叶片碳同位素组成δ¹³C,对比不同白刺居群间的叶片δ¹³C特征差异,并分析白刺叶片δ¹³C与地理位置信息及叶片营养和土壤养分含量指标的关系。结果显示:（1）白刺居群间叶片δ¹³C存在显著空间变异性,其叶片δ¹³C变化范围在-25.47‰~-27.66‰之间,平均为-26.66‰。(2）纬度、经度和海拔是白刺叶片δ¹³C重要影响因子,白刺叶片δ¹³C与纬度、经度和海拔分别呈极显著负相关,正相关和正相关关系（n=10）。（3）白刺叶片δ¹³C与叶片有机C含量、N、P、K含量总体均呈负相关关系,但仅叶片有机C含量达到极显著水平（n=30）,其余均未达到显著性水平（n=30）。（4）叶片δ¹³C与表层土壤（0~15 cm）有机质、全N、速效K含量呈极显著负相关关系（n=30）,与全P、碱解N和有效P含量呈显著负相关关系（n=30）,并与15~30 cm土壤有机质和全N含量显著负相关（n=30）,但叶片δ¹³C与30~45 cm土壤各化学指标相关性均不显著（n=30）。研究表明,环境因子纬度、经度、海拔,叶片有机C含量,以及立地土壤全N、全P、碱解N、有效P、速效K含量的变化均显著影响柴达木盆地唐古特白刺居群叶片δ¹³C值。