实时荧光定量PCR法研究溃疡性结肠炎患者肠道双歧杆菌属、柔嫩梭菌属及拟杆菌属量的变化

目的应用荧光定量PCR技术对人粪便内双歧杆菌属、柔嫩梭菌属及拟杆菌属进行定量检测,揭示肠道相关菌群改变在溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）发病中的作用及意义。方法分别设计双歧杆菌属、柔嫩梭菌属及拟杆菌属的特异性引物。收集溃UC患者粪便标本60份及正常对照标本60份,提取细菌基因组DNA,应用实时荧光定量PCR反应测定细菌的数量。结果UC患者组双歧杆菌属及柔嫩梭菌属的数量较正常对照组明显减少（P〈0．05）,而拟杆菌属的数量较正常对照组明显增多（P〈0．05）,差异有统计学意义。结论UC患者粪便中双歧杆菌属及柔嫩梭菌属的数量较正常对照明显减少,而拟杆菌属的数量较正常对照明显增多,提示肠道菌群与UC的发生、发展有一定的关系。     

结直肠腺瘤及结直肠癌患者肠道中梭杆菌属与产丁酸菌的定量研究

【目的】通过观察梭杆菌属(Fusobacterium spp.)和两株产丁酸菌(Eubacterium rectale、Faecalibacterium prausnitzii)在结直肠癌患者及结直肠腺瘤患者粪便样品中的丰度差异,研究梭杆菌属和产丁酸菌数量变化在结直肠腺瘤和结直肠癌发生发展中的作用和意义。【方法】收集结直肠癌患者(n=19)、结直肠腺瘤患者(n=12)及健康人(n=19)3组粪便样品,提取细菌基因组DNA,利用实时荧光定量PCR技术定量检测3组样品中梭杆菌属(Fusobacterium spp.)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)以及总菌的16S rRNA基因的拷贝数,然后利用秩和检验两两比较3组样品中目标菌群的数量和丰度差异。【结果】结直肠癌组的梭杆菌属丰度显著高于结直肠腺瘤组(P=0.013)和健康组(P=0.000),结直肠腺瘤组的梭杆菌属丰度显著高于健康组(P=0.002);结直肠腺瘤组普拉梭菌的丰度显著低于健康组(P=0.033);结直肠腺瘤组的总菌16S rRNA基因拷贝数也显著低于健康组(P=0.002);直肠真杆菌的水平在3组样品间没有显著差异。【结论】与健康人的粪便样品相比,结直肠腺瘤病人的粪便中产丁酸菌普拉梭菌数量下降,而结直肠腺瘤和结直肠癌病人的粪便样品中梭杆菌属数量增加;梭杆菌属和产丁酸菌数量上的变化提示它们可能与结直肠腺瘤和结直肠癌的发生密切相关。     

应用实时荧光定量PCR定量检测溃疡性结肠炎肠道大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的变化

目的应用实时荧光定量PCR（RT—PCR）法对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）患者粪便中大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的数量进行定量检测分析。方法根据细菌的16SrDNA基因序列设计大肠埃希菌、乳酸杆菌及双歧杆菌属的种属特异性引物。收集溃疡性结肠炎患者及正常对照者新鲜粪便标本各35例,从待测粪便标本中提取细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR反应,定量分析不同细菌的数量。结果正常对照组与病例组粪便中细菌数量分别为大肠埃希菌（4．62±1．10;5．27±1．02）、乳酸杆菌属（4．99±0．75;4．65±0．95）、双歧杆菌属（5．07±0．95;4．93±0．99）,病例组大肠埃希菌数量明显增多（t=2．540,P=0．013）,而乳酸杆菌及双歧杆菌属数量与正常组比较差异无统计学意义（t1=0．488,P,=0．530;t2=-0．533,P：=0．596）。结论溃疡性结肠炎患者粪便中大肠埃希菌的数量较正常对照明显增多,而乳酸杆菌及双歧杆菌属的数量无明显变化,提示大肠埃希菌与溃疡性结肠炎的发病或复发有关系,而乳酸及双歧杆菌属与此病的关系有待进一步研究。     

实时荧光定量PCR的应用和进展

实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理、优缺点及近年来新兴起的荧光探针的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR技术在动植物基因工程,微生物和医学领域的应用进行了比较全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及在基因诊断领域的前景做了进一步的展望。     

实时荧光定量PCR技术综述

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。与传统PCR相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测。     

新疆哈萨克族正常血压人群和高血压人群肠道菌群中拟杆菌属、梭菌属结构特征分析

目的分析新疆哈萨克族正常血压人群和高血压人群肠道菌群中拟杆菌属、梭菌属的结构特征,探讨两人群肠道两菌属的差异。方法使用16S DNA-PCR-DGGE技术比较哈萨克族正常血压人群和高血压人群肠道菌群中两菌属结构的差异,将差异条带克隆、测序,与GenBank数据库提供的序列进行比对,确定细菌种类。结果哈萨克族高血压人群肠道梭菌属的16S DNA V3区DGGE图谱中出现一条优势带,其在2组人群中出现的频率经分析后差异具有统计学意义(P0.05)。基因序列在GenBank数据库上用Blast程序进行比对,确定为Uncul-tured bacterium clone nbw1009b01c1。结论这种细菌可能会影响哈萨克族高血压的发生和发展。     

产气荚膜梭菌实时荧光PCR方法的建立

目的:利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的检测产气荚膜梭菌的方法。方法:以产气荚膜梭菌基因为靶序列设计引物和探针,以自产气荚膜梭菌菌株中提取的DNA为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的特异性、敏感性。结果:建立的反应体系在上游引物浓度为0.45μmol/L、下游引物浓度为0.15μmol/L、探针浓度为0.3μmol/L时,具有良好的特异性和敏感性,与创伤弧菌等12种相关细菌均无交叉反应;对纯菌检测的灵敏度低于10 CFU/反应体系。结论:建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对战时气性坏疽做出快速准确的报告,实现对这种战时高发疾病的安全、快速和定量检测。     

实时荧光定量PCR法研究附子、红参不同比例配伍对大鼠肠道菌群的影响

目的 应用实时荧光定量PCR法对灌胃给予不同配伍比例的附子和红参大鼠粪便中的总菌、乳杆菌和拟杆菌的相对含量进行检测分析。方法 将15只SD大鼠随机分成A、B、C三组,每组5只。A组：附子单独给药7 d,B组：附子、红参配伍比例1∶1给药7 d,C组：附子、红参配伍比例1∶2给药7 d。各组灌胃7 d结束之后,于第8天收集大鼠的粪便,提取粪便中细菌的DNA,并根据细菌的16S rDNA基因序列设计总菌、乳杆菌和拟杆菌的种属特异性引物,进行实时荧光定量PCR反应,分析不同细菌的相对含量。结果 C组大鼠中总菌、乳杆菌和拟杆菌的相对含量要显著高于A组和B组;A组和B组中总菌、乳杆菌和拟杆菌的相对含量没有明显差异。结论 当附子和红参的配伍比例为1∶2时,能在一定程度上改善肠道的微生态环境,促进有益菌的生长。     

实时荧光定量PCR的数据分析方法

实时荧光定量PCR是目前检测目的核酸拷贝数及分析靶基因在mRNA表达水平相对变化的主流技术。研究表明,分析结果的准确性依赖于数据分析方法的可靠性。我们简要综述实时荧光定量PCR的数据分析方法。     

实时荧光定量PCR相对定量法检测循环miRNA的内参选择

microRNA(miRNA)是一类内源性非编码微小RNA,在调控细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。研究发现,miRNA能够稳定存在于细胞外液,被称为循环miRNA。在多种疾病状态下循环miRNA表达谱改变,具有成为非创伤性新型生物标志物的潜能。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是检测miRNA表达变化的确证实验,其中内参的选择关系到相对定量结果是否真实可靠。我们简要综述国内外实验室常用的RT-qPCR内参及其特点。     

Biohydrogenation of linoleic acid by Clostridium sporogenes, Clostridium bifermentans, Clostridium sordellii and Bacteroides sp.

Abstract Several strains of Clostridium bifermentans, Clostridium sporogenes and Clostridium sordellit and one strain of Bacteroides sp. hydrogenate linoleic acid into transvaccenic acid in vitro following the same pathway. Linoleic acid (18:2; 9- cis , 12- cis ) was first isomerised into 9- cis , 11- trans -octadecadienoic acid, after which the 9- cis double bond was reduced. These species also hydrogenated linoleic acid into an octadecenoic acid in vivo when mono-associated with gnotobiotic rats. Several other species of Clostridium and Bacteroides did not hydrogenate linoleic acid.     

艰难梭菌感染与大肠癌及大肠腺瘤的相关性分析

目的 分析艰难梭菌感染与大肠癌及大肠腺瘤的相关性,为临床预防及治疗肠道肿瘤提供新思路。方法 收集2016年1月至2017年6月于甘肃省人民医院就诊的134例大肠癌患者、52例大肠腺瘤患者及100例健康对照者的粪便标本及临床资料,对粪便标本进行细胞毒性试验检测,分析大肠癌及大肠腺瘤与艰难梭菌感染的相关性。同时分析艰难梭菌感染与大肠癌临床特征及部分样本免疫组化（Her-2、P53、CDX2、CD56及Ki-67）结果的相关性。结果 （1）结直肠癌组检出13例艰难梭菌感染者（9.70%）,大肠腺瘤组检出2例艰难梭菌感染者（3.85%）,对照组未检出艰难梭菌感染者。结直肠癌组艰难梭菌感染率明显高于大肠腺瘤组及对照组（2=11.0953,P0.05）。（3）CDX2的表达与艰难梭菌感染具有相关性,CDX2阴性结直肠癌患者艰难梭菌感染率明显高于CDX2阳性患者（20.8% vs 2.8%,2=8.5224,P0.05）。结论 艰难梭菌感染与大肠癌的发生具有相关性,特别是与大肠癌病理分期及CDX2表达存在相关性。艰难梭菌感染与大肠腺瘤之间无显著相关性。     

结肠癌患者肠道菌群变化的临床研究

目的 对比分析结肠癌患者肠道菌群数量变化的特点,为结肠癌的治疗提供新途径。方法 选取2014年6月至2015年6月在本院就诊的结肠癌患者48例为试验组,同期在本院体检的48例健康者为对照组。取两组患者粪便标本进行传统菌落培养与计数检测,同时采用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）法检测肠道细菌相对含量与相关基因表达拷贝数。结果 菌落计数结果显示试验组大肠埃希菌、屎肠球菌和酵母菌数量多于对照组,而双歧杆菌和乳酸杆菌数量少于对照组,组间比较差异均有统计学意义（P0.05）。结论 结肠癌患者大肠埃希菌、屎肠球菌和酵母菌数量明显增加,双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显减少,肠道菌群数量变化在结肠癌的发生和发展中可能发挥一定作用。     

实时荧光PCR检测水产品中副溶血性弧菌

目的探索副溶血性弧菌快速检测法,应用于日常监测及食物中毒的快速查源。方法用副溶血性弧菌实时荧光试剂盒对水产品样本进行检验,以副溶血性弧菌toxR基因为靶序列,设计1对引物和探针,采用热裂解法提取DNA。结果实时荧光PCR从42份水产品样品的增菌液中检出13份样品副溶血性弧菌阳性,与传统培养法相比一致性极好（K=0.943,K〉0.75）。结论实时荧光PCR方法在副溶血性弧菌的检验方面较传统方法具有快速、灵敏、特异性强等优势,具有广阔的应用前景。     

具核梭杆菌对结直肠癌小鼠化疗敏感性的影响

目的研究具核梭杆菌对结直肠癌小鼠化疗敏感性的影响。方法建立结直肠癌荷瘤小鼠,分为空白对照组、5-氟尿嘧啶对照组和实验组、奥沙利铂实验组和对照组、伊立替康实验组和对照组、阿霉素实验组和对照组、丝裂霉素实验组和对照组,每组5只;各实验组荷瘤鼠灌胃给予具核梭杆菌菌液(10~9CFU),0.2 mL/d,1次/周。连续灌胃4周后,5-氟尿嘧啶实验组、阿霉素实验组、丝裂霉素实验组荷瘤鼠分别腹腔注射给予30.00 mg/(kg·d)、1.75 mg/(kg·d)、2.00 mg/(kg·d)对应药物,1次/d,连用7 d;奥沙利铂实验组、伊立替康实验组荷瘤鼠分别第1天腹腔注射给予29 mg/kg、66 mg/kg对应药物,其余6 d用生理盐水0.1 mL代替。各对照组荷瘤鼠除不灌胃具核梭杆菌菌液外,其余操作均与实验组相同。对比各实验组和对照组的瘤重和抑瘤率(IR%)。结果各组成瘤裸鼠一般情况均正常,肿瘤呈膨胀性生长,未见明显浸润或转移发生。各实验组荷瘤鼠的瘤重(g)均显著大于对照组荷瘤鼠[(1.42±0.15)vs(0.97±0.12),(1.76±0.16)vs(1.45±0.13),(1.50±0.09)vs(1.03±0.08),(1.38±0.07)vs(0.87±0.05),(1.26±0.08)vs(0.79±0.05);均P<0.05],IR%显著小于对照组荷瘤鼠[(27.55±2.83)vs(50.51±5.02),(10.20±1.78)vs(26.02±2.36),(23.47±2.76)vs(47.45±4.86),(29.59±3.02)vs(55.61±5.35),(35.71±3.47)vs(59.69±5.45);均P<0.05]。结论具核梭杆菌降低抗结直肠癌药物的敏感性。     

具核梭杆菌促进结直肠癌发生发展机制研究进展

具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)是一种人体共生菌,尤其富集于口腔,在特定情况下可导致机会感染.近年来,随着微生物群与健康或疾病相关性研究的深入,具核梭杆菌与结直肠癌(colorectal cancer,CRC)之间的关联性研究备受关注.大量临床研究表明,具核梭杆菌在CRC中更为富集,且进一步...     

肠道中特异性菌群与结直肠癌的发生发展关系

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见的恶性肿瘤之一,并且发病率有逐年上升的趋势。建立有效的早期筛查方法是当今防治结直肠癌的首要任务。随着肠道菌群研究的深入,越来越多的研究结果显示肠道菌群与CRC的发生发展有一定的关系,尤其是具核梭杆菌、产肠毒素脆弱拟杆菌、大肠埃希菌等这些特异性菌群与CRC的发展密切相关。本文结合国内外最新研究进展,就这些特异性菌群在CRC发病机制中的作用作一综述,为进一步研究CRC和实现对其早期筛查提供新的思路。     

Circannual variation of efficacy outcomes in patients with newly diagnosed metastatic colorectal cancer and treated with first-line chemotherapy

Seasonal variation of baseline diagnosis (or clinical suspect) of stage I–III colorectal cancer patients has been repeatedly reported as an independent variable influencing overall survival. However, data are conflicting and no information is available about such a rhythm in advanced stage patients. To test whether a circannual rhythm of efficacy outcomes can be detected in this setting, we collected data about response rate (RR), progression-free survival (PFS), and overall survival (OS) to first-line chemotherapy of 1610 newly diagnosed metastatic patients treated at four independent centers. Responses to first-line chemotherapy were available for 1495 patients. A strong circannual rhythm in RR was evident, with the higher proportion of responding patients in the subgroup diagnosed in January (acrophase). At the time of data cutoff, 1322 patients progressed and 986 died, with median PFS and OS of 11 and 25.6 months, respectively. A circannual rhythmicity of the proportion of patients progressing at 6 months and surviving at 1 year was demonstrated, with acrophases located both in winter (February and January, respectively), similar to what reported for RR. Several interpretations about the genesis of this cyclic variation could be claimed: the rhythm in sunlight exposure and, as a consequence, of vitamin D serum levels and folate degradation, the variability in toxic effect intensity of chemotherapy, and the rhythm in the biological behavior of tumor cells. This observation is worth of further investigation both in preclinical and in clinical settings in order to better elucidate the underlying mechanisms.