CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhNAC3基因编辑

为创制棉花耐旱种质资源,解决棉花耐旱资源贫乏以及提高水资源利用率,研究依据CRISPR/Cas9编辑原理,对课题组前期利用RT-PCR技术筛选耐旱相关基因GhNAC3(Gh＿D02G0790)的第一外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在陆地棉基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与gRNA-AtU6载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的AtU6-GhNAC3表达盒,再将表达盒连接到CRISPR/Cas9(pRGEB32-7)载体上,获得CRISPR-GhNAC3重组表达载体,利用农杆菌介导法转化陆地棉受体YZ-1,再生培养得到T₀代转基因幼苗,通过PCR检测Cas9蛋白基因获得阳性株系。对T₀代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定GhNAC3编辑类型。结果发现,CRISPR9-GhNAC3表达载体成功转化YZ-1,并获得40株转基因再生植株,经Cas9蛋白基因鉴定得到30株阳性株系,从阳性植株选择10株进行编辑类型测序分析,发现7株在靶点区域发生编辑,编辑类型主要为碱基片段缺...     

利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗

利用已构建的植物表达载体prd29a-dreb-hyg,通过酶切连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）的表达质粒pZMLR14上,构建植物表达载体pDREB-PMI。利用基因枪轰击转化甘蔗愈伤,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。对转基因植株进行分子检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因株系中均有表达。对转基因T₁代甘蔗植株进行分子检测,结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T₁代中稳定遗传。该结果为进一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基础。     

植物多基因干扰载体体系构建与效用分析

多数重要的功能基因属于多基因家族,这些家族成员间存在功能冗余,高效的多基因干扰体系对研究多基因家族成员的生物学功能及其分子调控机制具有重要意义。对pCAMBIA1301载体改造,构建了适用于植物的多基因干扰体系pCAMBIA1301m和pCAMBIA1301s。使用该多基因干扰体系构建了四基因的干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4,4个目标基因为来源于番茄PP2C家族A组的PP2C1、PP2C2、PP2C3和PP2C4,并通过遗传转化导入番茄,用GUS染色和PCR检测转基因阳性植株,再利用RT-qPCR技术检测T₁和T₂代转基因植株中目标基因的干扰效率,用T₂代种子分析转基因番茄对ABA敏感性。结果表明,应用该干扰体系成功获得了四基因干扰的转基因植株35S∷SlPP2C1-2-3-4。在转基因番茄中4个目标基因的表达量显著低于野生型,其干扰效率均高于70%,转基因番茄种子萌发具有强烈的ABA不敏感性。多基因干扰体系能高效地同时沉默多个目标基因。     

利用花粉管通道技术导入大豆抗病虫目的基因

采用花粉管通道技术,将几丁质酶基因导入14个大豆品种,共导入1125朵花,花朵的成活率为47.8%,将Bt基因导入11个大豆品种,共导入260朵花,花朵的成活率为40.8%。8个转Bt基因品种中的D1代共收获192粒种子,获得幼苗132株,出苗率为68.75%,把转Bt基因的132株植株用X-Gluc溶液检测,没有发现阳性反应,将转Bt基因的132株植株进行PCR检测,得到5株阳性转化植株,对D1代获得的5株阳性转化植株的D2代,进行PCR检测,得到D2代稳定遗传的阳性转化植株2株。     

利用CRISPR/Cas9鉴定玉米发育相关基因ZmCen*

目的: 利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) 系统构建玉米中心蛋白(Centrin)的表达载体,经转化后分析其对玉米生长发育的影响。方法: 针对ZmCen基因的第一个外显子设计sgRNA,将其连入pOMS01-Cas9-ZmCen-sgRNA表达载体,转化农杆菌GV3101后,侵染玉米自交系材料B104的愈伤组织,经继代、诱导、分化成苗,筛选出转基因后代。对T₀代和T₁代基因组DNA进行PCR验证、测序及表型分析。结果: 成功构建ZmCen的表达载体。侵染农杆菌后,PCR测序显示,T₀ 代和T₁ 代突变率分别为 20.13% 和 64.52%,其中T₁ 代的纯合缺失突变率为5%。序列分析表明,ZmCen基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换、插入或缺失。经与野生型表型比对发现,ZmCen 突变体T₁代植株出现发育缓慢且雄花序不完全发育表型,纯合突变体植株雄花序则完全不发育。结论: 通过 CRISPR/Cas9技术成功地对玉米ZmCen基因进行了编辑,ZmCen突变体的获得为玉米雄性器官发育相关基因的研究奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9鉴定玉米发育相关基因ZmCen*

目的: 利用CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) 系统构建玉米中心蛋白(Centrin)的表达载体,经转化后分析其对玉米生长发育的影响。方法: 针对ZmCen基因的第一个外显子设计sgRNA,将其连入pOMS01-Cas9-ZmCen-sgRNA表达载体,转化农杆菌GV3101后,侵染玉米自交系材料B104的愈伤组织,经继代、诱导、分化成苗,筛选出转基因后代。对T₀代和T₁代基因组DNA进行PCR验证、测序及表型分析。结果: 成功构建ZmCen的表达载体。侵染农杆菌后,PCR测序显示,T₀ 代和T₁ 代突变率分别为 20.13% 和 64.52%,其中T₁ 代的纯合缺失突变率为5%。序列分析表明,ZmCen基因的编辑靶点附近发生了碱基的替换、插入或缺失。经与野生型表型比对发现,ZmCen 突变体T₁代植株出现发育缓慢且雄花序不完全发育表型,纯合突变体植株雄花序则完全不发育。结论: 通过 CRISPR/Cas9技术成功地对玉米ZmCen基因进行了编辑,ZmCen突变体的获得为玉米雄性器官发育相关基因的研究奠定了基础。     

RNAi沉默淀粉分支酶基因SBEI对玉米直链淀粉合成的影响

淀粉分支酶(SBE)是淀粉合成的限速酶。为了研究SBEI沉默对直链淀粉合成的影响, 克隆了玉米(Zea mays)淀粉分支酶SBEI基因片段, 构建了SBEI的RNAi表达载体pBAC418, 用基因枪将其导入玉米自交系幼胚愈伤组织, 经木糖筛选获得了7株转化再生植株。利用FAD2 intron和xylA基因探针对T₀代再生玉米植株进行DNA dot blot和PCR-Southern检测, 证实5株为阳性植株, 其中4株正常结实。SBEI基因沉默对阳性再生玉米株系籽粒的含油量没有显著影响; 蛋白质含量显著高于受体对照; 总淀粉含量与对照相比无显著差异, 转基因株系直链淀粉含量平均提高了9.8%。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的真核表达载体的构建及表达

根据GenBank发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV) 5 2 70株VP2 基因序列 ,设计合成了 1对特异扩增IBDVVP₂ 基因的引物。以IBDV超强毒河南分离株HN0 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒RNA来制模板 ,利用RT PCR扩增出了 1 .4kb的VP₂ 基因 ,将其克隆到pIREShyg载体上 ,构建了pIRES VP₂ 真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞 ,通过潮霉素筛选得到阳性克隆 ,间接免疫荧光实验 (IFA)鉴定VP₂ 在CHO细胞中的表达 ,并用RT PCR的方法从转录水平证实VP₂ 在CHO k1细胞中的表达 ,最终建立了CHO VP₂ 细胞株 株。     

甘菊DlNAC1转录因子基因提高烟草耐高温能力

研究针对从甘菊中克隆获得的DlNAC1基因（GenBank登录号为EF602305）进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法将该基因在烟草中进行过表达研究。结果发现DlNAC1蛋白具有较高亲水性,二级结构中占比最高的为无规则卷曲,并具有N糖基化位点等6类潜在的模体结构和典型的由一个扭曲的反平行β片层和α螺旋组成的NAC结构域。将DlNAC1基因在烟草中过表达后,通过PCR方法从55株转化植株中鉴定出36株为阳性植株,并且转基因烟草T₀代植株在45℃高温胁迫后,转35S：DlNAC1基因阳性植株生长状况良好,而对照植株发生萎蔫,并且转基因植株叶片含水量显著高于对照植株。然而,在4℃低温胁迫后,发现转基因烟草T₁代植株没有提高耐低温能力。甘菊DlNAC1基因能够提高烟草植株耐高温能力,为今后菊花抗逆育种提供了科学依据。     

茎尖法转基因棉花植株真实性鉴定方法探究

棉花茎尖转化法具备不受基因型限制、转化周期短的优点,是理想的棉花转化体系,但据报道其所获得的转基因植株普遍存在遗传不稳定、高代植株基因丢失的现象。以陆地棉TM?1品种为受体材料,利用茎尖转化法将DsRed2载体转入棉花,经卡那霉素筛选获得16株抗性植株,进一步PCR扩增靶基因,获得6株DsRed2基因片段PCR检测为阳性的植株,初步判断该6株为茎尖转化法获得的转基因植株,但经紫外照射,6个转基因植株均未检测到红色荧光。对其进行靶基因RT?PCR,发现DsRed2基因在6个转基因植株中仅有极低量的表达或无表达。进一步对DsRed2载体的非T?DNA片段,即载体骨架部分进行PCR以及植株内生菌培养检测,结果表明,6个转基因植株均含有完整的DsRed2载体,植株可培养出含有完整载体的内生菌,且内生菌经农杆菌16S核糖体RNA（16S rRNA）片段PCR检测结果为阳性,推测由于茎尖侵染形成农杆菌与植株共生关系,造成假阳性株的现象,进而导致高代转基因植株基因丢失、遗传不稳定的现象。旨在建立一套完整的茎尖法转基因棉花植株真实性的鉴定方法,为进一步深入研究提供参考依据。     

大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi双元表达载体的构建及其转基因

植物类受体蛋白激酶(plant receptor-like kinases RLKs)以其特有的结构在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要的作用。利用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)来研究RLKs的功能已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理,以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基因,在rlpk2-cDNA序列3'端选择312bp作为构建RNAi的序列,借助中间克隆载体,经过三次亚克隆,最后形成含rlpk2-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-R2,并转入农杆菌LBA4404。采用农杆菌介导大豆子叶节转化方法,共获得了三株转基因植株。转基因植株 RT-PCR分析表明rlpk2基因已被成功敲减(knock-down),并且发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因表达明显改善大豆叶片的光合能力,结合前期研究结果,表明rlpk2基因可能在维持叶绿体的结构及保护叶绿体膜系统的完整性方面起负调节作用。     

Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck+cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料的选择标记基因

Cre/lox系统通过其Cre重组酶对lox序列进行切割和重新连接,介导lox序列发生特异性重组.利用重组报告基因系统Pactin-lox-hpt-lox-gusA,对Cre/lox系统在水稻(Oryzasativa L.)中介导转基因的剔除进行了研究.Pactin-lox-hpt-lox-gusA系统中选择标记hpt基因侧翼含两个同向lox位点,并位于水稻actinl启动子和gusA基因之间.当hpt在Cre酶作用下被剔除时,actinl启动子可以和gusA基因融合在一起从而驱动GUS表达.通过农杆菌介导获得了分别转cre基因、Pactin-lox-hpt-lox-gusA结构和双价抗虫基因lox-hpt-lox-sck-cryIAc结构的水稻.利用有性杂交方法将cre基因导入到转化lox结构的植株中.在4个转Pactin-lox-hpt-lox-gusA T0植株×转cre T0植株所配组合的30个杂交F1植株中,12个植株表达GUS活性,9个表现潮霉素敏感,表明hpt基因被剔除.研究进一步通过Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料基因组中的选择标记hpt基因.在9个转lox-hpt-lox-sck-cryIAcT2代纯合植株×转creT2代纯合植株所配组合的77个杂交F1植株中,56个植株表现潮霉素敏感.分子分析证实在这些对潮霉素敏感的植株中hpt基因已经被剔除.     

水稻谷蛋白GluA-2基因在小麦胚乳中的表达

水稻(Oryza sativa L.)谷蛋白(Glutelin)约占水稻储藏蛋白总量的80%,谷蛋白赖氨酸含量较高并易于被人体消化吸收.为了提高小麦(Triticum aestivum L.)的营养品质,将水稻谷蛋白GluA-2基因的cDNA序列导人小麦栽培品种Bobwhite(T. aestivum cv.Bobwhite).共轰击了600个小麦幼胚,经PCR和Southern杂交鉴定,共获得4棵转GluA-2基因小麦;SDS-PAGE分析表明,GluA-2基因在3棵转基因植株及其后代中表达,在1棵转基因植株中未表达,但其内源的高分子量麦谷蛋白亚基Bx7和By9含量显著降低,并且可遗传至T1代.     

玉米与籽粒苋不同种植模式下植物生长及Cd累积特征

为实现Cd污染农田边生产边修复的目标,采用田间原位修复的方式,将玉米与籽粒苋在Cd污染农田中以5种不同的间作模式种植: 交替宽窄行玉米宽行间作单行籽粒苋(T₁)、交替宽窄行玉米宽行间作双行籽粒苋(T₂)、等行距双行玉米间作单行籽粒苋(T₃)、等行距双行玉米间作双行籽粒苋(T₄)、玉米/籽粒苋等4行距间作(T₅),并以玉米(CK₁)和籽粒苋(CK₂)单作种植作为对照,探究不同间作结构配置对作物与超富集植物生长及Cd累积特征的影响.结果表明: 1)与CK₁相比,各间作模式单株玉米的籽粒产量呈增加趋势;T₁间作模式玉米的籽粒产量较CK₁增加10.5%,T₄和T₅间作模式玉米的籽粒产量较CK₁分别减少6.3%和5.4%,T₂和T₃间作模式基本稳产;间作籽粒苋地上部单株生物量及单位面积产量较CK₂分别显著减少69.5%～95.7%和83.9%～96.9%. 2)各间作模式玉米籽粒Cd含量较CK₁呈减少趋势,而间作籽粒苋Cd含量较CK₂呈增加趋势. 3)与CK₂相比,各间作模式籽粒苋的富集系数、转运系数、有效转运系数均呈增加趋势;间作籽粒苋地上部Cd的单株及单位面积提取量较CK₂分别显著减少40.4%～86.7%和70.4%～88.9%;各间作模式玉米与籽粒苋地上部Cd的单位面积提取总量高于单作玉米,但低于单作籽粒苋. 4)各间作模式玉米根际土有效态Cd含量及籽粒苋根际土总Cd、有效态Cd含量分别较单作玉米及单作籽粒苋呈增加趋势,但对非根际土没有显著影响.本研究中,T₁间作模式有利于玉米籽粒产量的提高,T₅间作模式有利于籽粒苋Cd提取量的最大化.     

不同水肥耦合下双季稻氮磷吸收、利用与流失差异

为优化双季稻水肥管理措施,在福建省东部双季稻区设置田间径流小区试验,研究了T₀(对照,未施肥+常规灌溉)、T₁[习惯施肥(273 kg N·hm^-2, 59 kg P·hm^-2, 112 kg K·hm^-2)+常规灌溉]、T₂[优化施肥(240 kg N·hm^-2, 52 kg P·hm^-2, 198 kg K·hm^-2)+常规灌溉]和T₃(优化施肥+节水灌溉)4种水肥耦合处理下双季稻产量、养分吸收利用及田面水氮、磷流失变化。结果表明: 与T₀相比,T₁、T₂和T₃处理早稻稻谷产量显著提高了0.7、1.0和1.1倍,晚稻稻谷产量显著提高了0.9、1.1和1.0倍;T₁、T₂和T₃处理早、晚稻植株地上部分,尤其稻谷氮、磷吸收量增加显著,早稻稻谷氮吸收量分别增加1.1、1.2和1.2倍,磷吸收量增加0.9、1.4和1.6倍,晚稻稻谷氮吸收量增加0.8、1.0和1.0倍,磷吸收量增加0.7、0.9和0.9倍。T₃比T₁处理早稻氮、磷肥农学利用率分别显著增加71.1%和69.2%,晚稻分别显著增加26.4%和25.0%,但田面水可溶性总氮流失量减少了16.0%,并以硝态氮流失为主;T₂与T₃处理早晚稻氮、磷肥农学利用率差异均不显著。本试验中的优化水肥管理措施(T₃)既能促进水稻氮、磷吸收利用,提高双季稻产量,又能降低早稻田面水氮素尤其是硝态氮的流失。本研究可为福建省东部双季稻区水肥利用管理和氮、磷面源污染防治提供理论支持。