用单个细胞转移技术进行杂交瘤的克隆化

<正>本文所报导的克隆杂交瘤的方法,是用一根毛细管连接一套抽吸装置,进行单个细胞的转移。这一方法可以有效地从培养的亲本杂交瘤中重新获得数量比例不同的抗体产生克隆。4个细胞株用这一方法再克隆获的了100％阳性。     

分泌胃酸的质子泵克隆化

日本大阪大学二井将光教授和前田正知副教授等研究组克隆了分泌胃酸质子泵、(H~++K~+)ATP酶的人染色体基因,在世界上首次在分子水平上弄清了胃酸质子泵的状态。这项研究将解开主要因胃酸分泌过多引起的胃溃疡之谜。目前,这种酶是正在日本进行临床开发的抗溃疡剂即质子泵抑制剂的目标酶。在上述研究成果的基础上正在研究其作用机制。因为是膜蛋白,故结晶困难,但今后立体结构研究清楚后,也许就能从理论上设计出质子泵抑制剂。     

王子制纸克隆化分解木质素的酶—酚氧化酶

王子制纸中央研究所在世界上第一次克隆化分解木质素的白色腐朽菌毛革盖菌的酚氧化酶,并测定了碱基序列。在京都大学化学研究所教授高浪满和理化学研究所主任研究员掘越弘毅的指导下,从毛革盖菌的mRNA和染色体中克隆化了酚氧化酶基因。王子制纸中央研究所花费1亿6千万日元在中央研究所内设置与P_2     

体内生物钟基因的克隆化

果蝇是遗传学研究中经常使用的材料它的Per基因位点有维持体内生物钟的重要作用。当该基因发生突变时,行动的日节律(体内生物钟决定的动物日节律)即不再是24小时左右,有时可长达29小时,有时     

人肿瘤浸润淋巴细胞的克隆化

肿瘤组织经机械剪切和酶消化分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL在含1000U/ml重组人白细胞介素-2(rhIL-2)的培养液中培养6d后,植入含1000U/ml rhIL-2的软琼脂半固体培养基中培养,7d后将形成的克隆转移到含rhIL-2的培养液中培养。~(51)Cr释放法测定结果表明,约30％的克隆对NK敏感的K562细胞和对NK不敏感的H7402肝癌细胞有细胞毒性,为具有杀瘤活性的TIL杀伤克隆(TIL-K)。60％以上TIL-K克隆在含IL-2的培养液中可持续地增殖2～3个月,其细胞数可扩增至10~8～10~9,并始终保持对肿瘤细胞的细胞毒性。TIL-K克隆的表型为CD3~ 、CD4~-、CD8~ 、CD16~-,有T细胞抗原受体β链基因的表达,说明其属T细胞系统。采用半固体-液体两步培养法可获取大量高纯度具有广谱杀瘤活性的TIL,本研究有助于TIL的深入研究和临床应用。     

用大肠杆菌同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组

利用大肠杆菌细胞内质粒间同源重组获得克隆化重组腺病毒基因组 DNA,高效构建携带有外源基因的均一重组腺病毒 .将带有狂犬病毒糖蛋白 (GP)基因和加强型 GFP(enhanced GFP,EGFP)表达盒的重组穿梭质粒 p Ad- Track- CMV/ GP与腺病毒骨架载体质粒 p Ad Easy- 1一起同时电击共转化大肠杆菌 BJ51 83.在 BJ51 83细胞内 ,带有同源序列的重组穿梭质粒与骨架载体可进行同源重组 ,得到以质粒形式存在的克隆化重组腺病毒基因组 p Ad- GP’.以 p Ad- GP’为模板 ,经DNA测序确认 GP基因成功整合入此质粒中的腺病毒基因组 E1区外源基因表达盒中 .线形化的p Ad- GP’转染 2 93细胞后可得到基因组结构均一、在 E1区插入有 GP和 EGFP表达盒的重组腺病毒 ,病毒滴度可达 1× 1 0 8pfu/ ml.电镜下此重组病毒颗粒直径约为 70 nm,略呈球形 ,用荧光显微镜观察感染细胞有很强的 EGFP表达 .实验表明 :利用大肠杆菌同源重组获得克隆化的重组腺病毒基因组 DNA,可高效制备高滴度的均一重组腺病毒     

京都大学克隆化小檗碱的生物合成基因

日本京都大学农学部教授山田康之等克隆化植物次生代谢产物小檗硷的生物合成基因成功。准备于4月在东京召开的日本农艺化学会上详细发表。如果把小檗硷的生物合成基因的研究作为典型事例,今后就能克隆化类似植物的与有用次生代谢产物有关的生物合成基因,利用由此基因产生的酶的酶促转化等,从而扩大有效地生产有用物质的研究开发的范围。这项研究是与京都大学医学部教授中西重忠共同进行的。山田等以中的小檗硷高生产株为材料,精制了生物合成小檗硷的酶 te-     

克隆化反向杂交探针的制备

反向斑点杂交是将寡核苷酸探针固定在膜上,用标记的靶序列与固定在膜上的探针进行杂交．与正向杂交相比,它通过一次杂交即可确定多种基因型,是一种快速筛查DNA点突变的诊断方法.我们选择β－地中海贫血基因-28 (A→ G), CD17 (A→T) and CD41～42 (-TTCT) 三种点突变为模型采用PCR扩增产生串联多拷贝序列探针并将其克隆化．将克隆化探针固定于尼龙膜上,与同位素标记的β－珠蛋白基因PCR片段进行杂交,检测β－地贫患者的基因型．     

人外周血中LAK细胞的克隆化

本文报道首次采用半固体-液体两步法克隆正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)获得成功。先用含重组人白细胞介素2(rhIL-2)的软琼脂半固体克隆外周血中的T细胞,再将T细胞克隆转移至96孔板中继续在含rhIL-2的液体中培养。~(51)Cr释放的结果表明,约10～30％的克隆对NK敏感的K562细胞和NK不敏感的H7402、Anip-1肿瘤细胞均有细胞毒性,即为LAK细胞克隆。LAK细胞克隆能在体外含rhIL-2培养液中增殖1.5～3.0个月,每个克隆可扩增至10~9～10~(10)个细胞,仍然维持LAK细胞活性。表型分析的结果表明,克隆的LAK细胞CD3( )、CD8( ),属T细胞系统。有增殖能力的LAK前体细胞在PBMNC中的频率约为1～3×10~(-4)。用有限稀释法将LAK细胞克隆进一步亚克隆,98％以上的亚克隆均有LAK活性,表型也和原克隆相同,证实原克隆具有克隆源性。本文的两步法克隆LAK细胞程序可在较短时间内获得大量均一的LAK细胞,极大地有助于LAK细胞的深入研究和广泛应用。     

克隆化烟草花叶病毒感染特异蛋白的cDNA

日本农林水产省农业生物资源研究所细胞育种部细胞生理学研究室大桥佑子、分子育种部生育基因研究室松冈信等,对烟草感染烟草花叶病毒(TMV)而诱导产生的感染特异蛋白(PR)的cDNA克隆化成功,还查明了它的碱基序列。抗TMV的品种,PR的产量有较多的趋势。他们一方面加速对生理活性进行分析,现在还正在克隆化染色体组DNA。如能查明     

美国威斯康星大学克隆化控制植物摄取肥料的膜蛋白基因

威斯康星大学的Michael Sussman等成功地克隆化了存在于植物细胞膜上的特殊蛋白的基因,并确定了DNA碱基序列。这种蛋白控制营养分进入植物和在植物内的移动。Sussman等已开始研究向番茄、马铃薯、烟草中导入这种基因。一旦能在植物根毛大量生产这种蛋白,就能加强从土壤中摄取养分,从而提高肥料的效率,也就可以提高肥料的摄取效率。原先已在细菌、菌类、动物细胞中肯定了同样的蛋白。现在,Sussman等已从与甘     

人NK细胞克隆化培养条件的初步探讨

为探讨NK细胞克隆化培养的条件,我们首先将人外周血单个核细胞经rhIL-2诱导,使NK细胞得以扩增后,去除T细胞,得到相对纯化的NK细胞.经有限稀释,在饲养细胞及rhIL-2、PHA及LCM等培养条件下,获得NK细胞的单个克隆并进行鉴定.结果表明,每96孔板可获4-16个CD3-CD56+NK克隆,每个克隆的细胞数最多可达2.35×104,存活约3-5周.以丝裂霉素C(25μg/m1)作为饲养细胞抑制剂,以rhIL-2 200u/ml、PHA 10μg/ml及10%LCM培养,可获得较多的克隆和细胞数.     

二种新的酿造用酶:脱支酶和葡聚糖酶

在低糖啤酒的生产中,采用外加酶法比传统的方法(如延长糖化休止期,使用高糖化力麦芽,往麦汁中添加糖或葡萄糖浆等)更优越,因此,酶在啤酒酿造中的应用也越来越受到人们的重视。本文介绍二种新的多糖降解酶。其一,支链淀粉酶(脱支酶),其商品名为Promozyme,可单独用于糖化、麦汁处理或发酵过程,以增加麦汁的发酵力;该酶发酵过程同霉菌α-淀粉酶一起使用时,外观发酵度可超过100％。另一种多组份碳水化合物分解酶SP-249能降解大麦和     

非缺失型α地中海贫血基因的克隆化分离

从一例基因型为αα~T/—的血红蛋白H病患者的手术切除脾制备了染色体DNA,用BamHⅠ水解后,回收14±1kb的DNA片段,作为插入体。以λEMBL_4噬菌体经非超离心法制备基因组DNA作为替换载体。经BamHⅠ水解回收左右臂,与α地贫脾DNA 14kb片段连接,包装、传染后,得10~4—10~5重组噬菌体/μg。以人α珠蛋白基因特异的探针作Benton原位杂交,M4×10~3克隆中筛出两个含α珠蛋白基因序列的克隆株。其中一株扩增后制备的重组DNA经酶解图谱及Southern印迹杂交鉴定,中间可替换部分含有14kb的人α珠蛋白基因组DNA。从而在我国首次从中国地贫病人中,以基因工程的方法,分离了克隆化的非缺失型α地贫基因,为研究其结构与功能打下了重要基础。     

促使细胞自杀的“Fas”的cDNA克隆化成功

大阪生物研究所第一研究部长长田重一与东京都临床医学综合研究所细胞生物研究部门的米原伸等研究组成功地实现了蛋白“Fas”的cDNA的克隆化并发表在Cell杂志91年7月26号(P233—243)。 抗Fas抗体具有类似于TNF的作用,但TNF不与Fas抗原结合,最早米原提出了这样     

克隆化小麦Cys合成酶基因培育抗酸雨的针叶树木

秋田县农业短期大学附属生物工程研究所教授佐野浩等克隆了小麦的 Cys 合成酶基因,导入烟草,用     

克隆化探针中载体与临床样品同源性的研究

当前,克隆化探针(由病毒核酸片段和细菌质粒一载体组成)在临床样品的实验诊断和研究中得到了应用。它具有简便、快速、灵敏等优点,并有助于检测那些难于或不能培养的病毒。但是克隆化探针中载体与临床样品的同源性问题应引起重视。我们用常见的克隆载体pBR322作探针,用核酸点杂交和Southern吸印方法,检测了来自173人的213例样品。结果表明,在常用的临床样品:人宫颈脱落细胞、宫颈活检组织、血液中都含有pBR322 DNA的同源序列,这就意味着如果用克隆化探针检测这些临床样品时,可能出现样品与载体发生非特异性反应,而不是与病毒基因片段的特异性反应。实验还表明,经一次电泳纯化的病毒基因片段与pBR322探针杂交,阳性信号明显减弱,但没有完全消失,说明仍有少量pBR322污染。因此,在运用克隆化探针检测临床各类样品时,各系统要按常规设载体探针对照,或者用多次纯化的分离病毒基因片段作探针,以排除载体与临床样品的同源性问题。     

T细胞生长因子与甲型流感病毒Tc细胞的克隆化

本文作者结合个人在英国国立医学研究所免疫系建立的第一株甲型流感病毒特异的Tc克隆,并描述了其生物学特性,撰写此文,对TCGF做概括性讨论。     

Immunex公司克隆化使未分化淋巴球细胞增殖的新因子 IL7

美国Immunex公司(华盛顿州Seattle)克隆化白细胞介素(IL)7成功。该物是作用于骨髓细胞、使淋巴球前体细胞增殖的新的细胞激动素(参阅1988年6月6日号BI)。该公司的研究开发部长Steven Gillis说:“正在研讨开发抗癌剂和放射线疗法等副作用产生的免疫抑制的治疗药,并已经着手临床试验。”通过JL7的表达,解明现在不