人源抗狂犬病毒单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达

以人源抗狂犬病毒糖蛋白母本单链抗体ScFv为模板,利用PCR点突变分别在重链FR可变区VH(44)和轻链FR可变区VL(100)分别引入一个半胱氨酸,成功构建了重组单链二硫键稳定抗体基因。连接pET22b( )载体,转化入E.coli BL21(DE3)得到工程菌,IPTG诱导表达。体外复性并经Ni-NTA亲和层析对目的蛋白ScdsFv进行纯化;利用荧光抗体实验和ELISA检测抗体活性及稳定性。结果表明重组ScdsFv蛋白实现了原核高效表达,通过体外复性和Ni-NTA柱纯化获得纯度大于90%的ScdsFv蛋白。荧光抗体实验和ELISA结果表明ScdsFv具有特异的抗原结合活性,与母本ScFv比较,稳定性有明显提高。这种具有特异抗原结合活性的稳定ScdsFv蛋白的获得为其进一步的功能研究提供了材料。     

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET-ompA3-hGH/BL21(DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 250mg/L ,占周质蛋白的 44%～ 54% ,发酵周期缩短为8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到96%以上 ,纯化产物在分子质量大小、免疫活性和二硫键的形成与天然生长激素相一致 。     

抗VEGF单克隆抗体Fab片段在E.coli中的分泌表达

目的：在大肠杆菌中构建、表达和纯化抗血管内皮生长因子（VEGF）的Fab片段（兰尼单抗,ranibizumab）,通过发酵条件的控制实现其在大肠杆菌周质和胞外的高效分泌表达,并检测其抗VEGF的活性。方法：以pET30a为质粒载体,构建了Fd链和L链前都含有OmpA信号肽、SD序列和T7 promoter的克隆载体pET30a（+）-LC-HC,转化BL21（DE3）表达菌株,并进行了培养基、温度和IPTG诱导浓度的条件优化。结果：确定Fab片段在大肠杆菌分泌表达摇瓶发酵最佳条件为：在含有1.5% Tryptone,1% Yeast Extract,0.5% Glucose,0.15% NaCl,0.1% NH₄Cl,0.08% MgCl₂·6H₂O的1L培养基的摇瓶中,按照10%的接种量,37℃摇床培养至对数生长后期（OD₆₀₀为2左右）,添加0.1mmol/L IPTG诱导剂,于16℃条件下诱导表达过夜（16h左右）。用周质破菌提取分泌至大肠杆菌周质腔的Fab片段,同时用中空纤维柱浓缩发酵培养基,最后用ProteinG亲和层析柱一步纯化洗脱,经SDS-PAGE检测分析和Brandford法测蛋白浓度得出纯化的Fab抗体片段纯度在90%以上,分泌表达纯化量为0.4mg/L。以VEGF165作为结合抗原,间接ELISA分析纯化后的Fab抗体EC50=30ng/ml。继续用该培养基在3.7L体积发酵罐中进行2L体积的发酵,获得最终的菌体产率为30g/L,可亲和纯化Fab抗体量为1.94mg/L。结论：成功实现了Fab抗体片段在大肠杆菌中的高效分泌表达,且具有很高的活性,为规模化制备Fab抗体片段提供了研究依据。     

A型肉毒毒素中和抗体3D12的表达

目的:表达A型肉毒毒素(Bo NT/A)中和抗体3D12。方法:按哺乳动物偏好密码子设计合成3D12轻链(L)和重链(H)编码序列,分别连入L293、H293表达载体,共转染至HEK293细胞进行瞬时表达并纯化;通过ELISA检测3D12效价、3D12与Bo NT/A受体的竞争结合作用及与Bo NT/AHc的亲和力常数,通过Western印迹鉴定3D12的特异性。结果:得到轻链(L293-L)及重链(H293-H)表达载体;瞬时表达并纯化得到抗体3D12;ELISA结果显示3D12效价为1.22×106,3D12与Bo NT/A受体FGFR3、SV2C之间不存在竞争结合作用,3D12的亲和力常数K=10.6×108L/mol;Western印迹显示3D12与Bo NT/AHc能够特异性结合。结论:得到A型肉毒毒素中和抗体3D12,为肉毒毒素中和抗体的开发及阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

抗TNF-α单链抗体的表达及其纯化

克隆抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)鼠源单抗的可变区基因以构建其单链抗体(ScFv)表达载体,实现在大肠杆菌的表达,并进行ScFv的可溶性纯化与鉴定。采用RT-PCR技术,以前导肽序列的引物从1个分泌抗人TNF-α的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆抗体轻链、重链可变区基因(VL,VH),构建ScFv基因,将ScFv基因片段与pGEX-4T-1表达载体连接,在大肠杆菌中表达并采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)进行可溶性纯化,最后鉴定其生物活性。结果显示,得到了功能性重排的轻、重链可变区基因,分别构建了VH和VL不同连接顺序的HLL(VH-Linker-VL)和LLH(VL-Linker-VH)两种ScFv,LLH的表达量较HLL的高,但亲和力不及HLL。采用Sarkosyl溶解包涵体,对目的蛋白进行可溶性纯化,蛋白纯度达到90%,纯化后的蛋白经ELISA和WB证明ScFv维持了亲本抗体与TNF-α特异性结合的能力,且具有细胞毒中和活性。实验中研究探索了一种新颖的,操作简单,省时的裂解、纯化方案,实现了单链抗体经原核系统的表达后得以可溶性纯化。     

靶向人表皮生长因子受体3的人源Fab抗体构建及鉴定

目的:制备靶向人表皮生长因子受体3(HER3)的全人源Fab型抗体,并对其亲和力及生物学活性进行鉴定。方法:用Bsp QⅠ限制性内切酶分别将靶向HER3的全人源抗体的完整轻链、重链的可变区全长和CH1恒定区插入载体p3457,构建重组质粒;通过将轻、重链质粒瞬时共转染293E悬浮细胞进行表达,并利用镍柱纯化得到Fab型抗体蛋白;采用ELISA鉴定其与HER3胞外区是否结合,Forte Bio实验鉴定其亲和力,CCK8检测其对MDA-MB-453细胞增殖能力的影响。结果:分别获得表达轻链全长、重链可变区全长及CH1恒定区的HER3抗体重组质粒,并通过瞬时共转染293E悬浮细胞获得分泌型HER3 Fab抗体;ELISA实验证明其可与HER3胞外区蛋白直接结合;Forte Bio实验证明Fab型抗体与人源HER3胞外区蛋白具有一定的亲和力(KD=1.08×10-8mol/L);体外增殖实验表明,该抗体可显著抑制MDA-MB-453体外增殖。结论:通过293E悬浮细胞表达、镍柱亲和纯化,获得具有较高亲和力和功能活性的HER3 Fab型抗体,为HER3高表达型癌症的诊断、治疗提供物质基础。     

抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。     

重组蛋白融合信号肽在大肠杆菌周质空间表达的研究进展

重组蛋白在大肠杆菌中表达时,往往面临着形成包涵体的问题,而重组蛋白若是分泌至周质空间则基本解决了这一问题,周质空间的周质蛋白不仅能帮助重组蛋白正确折叠还有利于二硫键的生成。信号肽是一段由15-30个氨基酸组成,被融合在重组蛋白N端的短肽,按照结构、功能的不同可以划分为N区、H区和C区,具有引导重组蛋白转运至细胞周质空间的作用。本文综述了信号肽的结构组成、作用机理和基本分泌途径,讨论了信号肽的高效转运和筛选方法,总结了在大肠杆菌中重组蛋白融合信号肽实现周质表达的新进展,并对未来高效信号肽选择方面的研究进行了探讨。     

重组蓖麻、相思子毒素A链嵌合突变体的制备与分析

目的:构建蓖麻毒素(RIC)、相思子毒素(ABR)A链突变体的嵌合体蛋白,实现嵌合体蛋白的可溶性表达、纯化及抗原性分析。方法:采用柔性linker连接RIC A链突变体(mRICAD75AV76MY80A)和ABR A链突变体(mABRAE164AR167L),构建嵌合体基因mRICA/mABRA,将该嵌合体基因亚克隆至原核载体pQE80L构建表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA,再转化至大肠杆菌M15获得表达工程菌株M15/pQE80L-mRICA/mABRA,工程菌在18℃经0.1 mmol/L的IPTG诱导14 h,表达的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,通过ELISA和Western印迹检测嵌合体蛋白的抗原性。结果:所获得的mRICA/mABRA嵌合体基因经一致性比对分析,与预计嵌合基因的序列一致性为100%,其开放读框全长1572 bp,编码524个氨基酸残基;重组表达质粒pQE80L-mRICA/mABRA经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,嵌合体蛋白相对分子质量约为62×103,与预测相符,可溶性的嵌合体蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,纯度可达99%;间接ELISA和Western印迹结果表明,嵌合体蛋白能同时与抗RIC多克隆抗体和抗ABR多克隆抗体发生特异的抗原抗体反应。结论:得到的mRICA/mABRA嵌合体蛋白具有良好的抗原性,为研制新型RIC和ABR双价疫苗奠定了重要基础。     

抗肿瘤血管三结构域单链抗体VH/L的构建与表达

以本室研制的一株抗肿瘤血管单克隆抗体AA98为基础,采用PCR扩增抗体AA98基因的重链可变区(V_H)和轻链(L),以重链恒定区1(C_H1)5′端12个氨基酸的序列作为连接肽,并将连接肽中的Lys突变为Ser,构建VH连接肽-L三结构域单链抗体。重组VH/L单链抗体在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占菌体总蛋白质的20%。表达的蛋白质在菌内形成包含体,经凝胶过滤法复性,获得了有抗原结合活性的V_H/L。该三结构域单链抗体的成功构建和复性,为重组抗体片段的研制提供了借鉴。     

SARS-CoV-2中和性纳米抗体的原核表达及中和活性检测

纳米抗体(nanobody,Nb)作为目前已知的能与目标抗原结合的最小单位抗体,在生物医药、临床研究等方面具有良好的应用前景。根据大肠杆菌密码子偏好性优化合成严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)中和性纳米抗体H11-D4基因,将其克隆到pET28a表达载体上后,转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)进行诱导表达,通过镍柱纯化、质谱分析、Western Blot鉴定H11-D4的表达情况并使用中和试验验证其中和活性。研究结果显示,纳米抗体H11-D4可成功在大肠杆菌中表达,最佳诱导条件为IPTG终浓度1.0 mmol·L^-1,37℃诱导5 h。H11-D4抗体的分子量大小约为17.9 kD,与预测值相符。经镍柱纯化后,产量为25.16 mg·L^-1。透析复性后利用TritonX-114快速有效地去除了内毒素,中和试验成功验证了H11-D4的中和活性(IC50)为171.1 nmol·L^-1,研究结果可为...     

一种来源于大菱鲆的热敏型尿嘧啶DNA糖苷酶的克隆表达及酶学性质鉴定

目的:尿嘧啶DNA糖苷酶UDGase是一种广泛应用于q PCR、二代测序等领域的工具酶,由于其应用特性,只有热敏性UDGase才具有较大开发利用潜力。目前全球热敏性UDGase工具酶仅有2个物种来源,均有专利保护且价格昂贵,亟待开发新来源且具有优良热敏特性的UDGase。方法:根据前人研究及序列分析推测大菱鲆(Scophthalmus maximus)具有热敏性UDGase。经验证,大菱鲆肝脏匀浆呈现UDGase活性。从大菱鲆肝脏匀浆克隆得到大菱鲆UDGase基因SmUDGase,并使用大肠杆菌工程菌株实现重组表达,分离纯化后进行活力表征检测。结果:序列比对结果表明,SmUDGase基因克隆成功。重组表达并经亲和层析、离子交换层析分离纯化,获得纯酶纯度约95%,产率1. 51mg/L,比活力2 295. 08U/mg。Sm UDGase具有热敏性,在40℃时酶活即开始迅速降低。其他酶学性质,如pH适应范围、金属离子依赖性和对抑制剂的敏感性均与当前商业化UDGase一致。结论:成功克隆并鉴定来自大菱鲆的新来源SmUDGase,该酶具有热敏感性,酶学特性接近目前商业化UDGase。并探索该酶的重组表达和纯化工艺,所得纯酶基本达到商业化生产水平,为该类型生物工具酶的开发提供了理论参考和技术储备。     

增殖细胞核抗原蛋白在Spodoptera frugiperda昆虫细胞中的表达及纯化

目的:利用昆虫细胞表达系统生产重组的人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA),并进行纯化和抗体结合特性鉴定。方法:以HeLa细胞逆转录的cDNA为模板,扩增人PCNA基因,并插入杆状病毒载体AcMNPV。利用昆虫细胞得到PCNA基因的重组杆状病毒。病毒感染细胞表达蛋白,联合镍柱亲和层析和离子交换层析获得高纯度的重组人PCNA蛋白。ELISA法测定抗体结合特异性。结果:以HeLa细胞cDNA为模板得到的基因序列同GenBank的人PCNA基因序列一致。草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda,Sf9)表达重组人PCNA(recombinant human PCNA,rPCNA)的最佳感染值(MOI)和感染时间分别为0.05h和144h。rPCNA的产量高达110mg/L细胞,纯度95%。间接ELISA法检测抗体结合特性,rPCNA的敏感性和特异性分别为93.3%和85.0%。结论:建立了rPCNA的表达和纯化方法,获得了高效表达、高度抗体结合特异性的PCNA蛋白,该蛋白质能进一步开发为PCNA相关疾病的体外诊断试剂盒,具较大的应用价值。     

枯草芽孢杆菌Mn-SOD基因的克隆及原核表达

为了实现Mn-SOD基因在大肠杆菌(E.coli)中的可溶性表达,根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168sodA核酸序列设计引物,以枯草芽孢杆菌ATCC 9372基因组为模板,PCR扩增获得了Mn-SOD基因.将此基因重组至原核表达载体pET-28a,构建含Mn-SOD基因的重组表达质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3).异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得Mn-SOD,蛋白分子量约为26kD,占全菌蛋白的5.6%.改良的连苯三酚自氧化法测定SOD活力,菌体可溶性总蛋白SOD比活为51.09U·mg^-1,是对照组的.8倍.枯草芽孢杆菌ATCC 9372 Mn-SOD基因在大肠杆菌BL21(DE3)中首次成功表达,产物具有较高的可溶性和活性,为大量制备Mn-SOD奠定了基础.     

Ester production in E. coli and C. acetobutylicum

Genetic engineering has improved the product yield of a variety of compounds by overexpressing, inactivating, or introducing new genes in microbial systems. The production of flavor-enhancing ester compounds is an emerging area of heterologous gene expression for desired product yield in Escherichia coli. Isoamyl acetate, butyl acetate, ethyl acetate, and butyl butyrate are reported here to be produced by expressing Saccharomyces cerevisiae genes ATF1 or ATF2 and the strawberry gene SAAT in E. coli when the appropriate substrates are provided. Increasing the concentration of alcohol added to the reaction generally resulted in increased ester production. ATF1 expression was found to produce more isoamyl acetate and butyl acetate than ATF2 expression or SAAT expression in the strains and culture conditions examined. Additionally, SAAT expression resulted in greater isoamyl acetate and butyl acetate production than ATF2 expression. Butyl butyrate is produced by cell-free extracts of E. coli harboring SAAT but not ATF1 or ATF2.     

A fragment of the yeast DNA repair protein Rad4 confers toxicity to E. coli and is required for its interaction with Rad7 protein

The RAD4 gene of Saccharomyces cerevisiae is required for the incision of damaged DNA during nucleotide excision repair. Plasmids carrying the wild-type RAD4 gene cannot be propagated in Escherichia coli. In this study, a rad4 mutant that can be grown in E. coli was isolated. This rad4 allele is deleted of a large positively charged segment of the RAD4 coding region which is toxic to E. coli when expressed alone. The deletion mutant retains its ability to interact with Rad23 protein but not with Rad7 protein and is defective in nucleotide excision repair. The smallest Rad4 fragment that is toxic to E. coli consists of 336 amino acids with a calculated pI = 9.99.     

温泉宏基因组来源的D-来苏糖异构酶性质研究*

目的: 从高温温泉宏基因组中挖掘能够高效催化合成稀有糖的新耐高温D-来苏糖异构酶。方法: 从云南昌宁鸡飞温泉底泥中提取宏基因组DNA并进行高通量测序,经基因注释及序列比对鉴定D-来苏糖异构酶基因,构建大肠杆菌异源表达载体并诱导表达,通过亲和层析纯化重组蛋白并对其性质研究。结果: 从温泉底泥宏基因组测序结果中鉴定得到8个D-来苏糖异构酶基因,选择4个基因进行异源表达,其中JF-LI1和JF-LI4在大肠杆菌中成功表达并检测到酶活性。研究表明,JF-LI1和JF-LI4的最适温度分别为70℃和75℃。JF-LI4具有较宽的作用温度和良好的热稳定性,在30~100℃的温度范围内剩余40%以上的酶活力。JF-LI1和JF-LI4的最适pH分别为7.0和7.5,在中性偏酸性条件下具有较高的活力和较强的稳定性。重组JF-LI1和JF-LI4具有较宽的底物谱,除了对D-来苏糖活性最高外,对L-核糖、L-核酮糖、D-果糖和D-甘露糖均具有活性。重组JF-LI1和JF-LI4对L-核糖的催化效率分别为0.56 L/(mmol·s^-1)和0.61 L/(mmol·s^-1),是目前已知的D-来苏糖异构酶中最高的。结论: 从高温温泉宏基因组中获得8个新的D-来苏糖异构酶基因,对JF-LI1和JF-LI4进行异源表达和性质研究,具有pH稳定性好、热稳定性强以及底物特异性宽泛的特点,在制药、食品、化妆品等工业领域有重要的应用潜力。     

Extracellular secretion of STa heat-stable enterotoxin by Escherichia coli after fusion to a heterologous leader peptide

The mature 19-amino acid STa heat-stable enterotoxin of E. coli has a preceding peptide of 53 amino acids which contains two domains called Pre (aa 1–19) and Pro (aa 20–53) sequences, proposed to be essential for extracellular toxin release by this host. The Pro sequence, however, has been proven not be indispensable for this process since Pro deletion mutants secrete STa. To find out if Pre and/or other unremoved natural STa flanking sequences are responsible for toxin secretion in those mutants we genetically fused mature STa directly to the leader peptide of the periplasmic E. coli heat-labile enterotoxin B-subunit (LTB). Expression of this gene fusion resulted in extracellular secretion of biologically active STa by E. coli independently of natural STa neighboring genetic sequences. Moreover, these results suggest that STa might be able to gain access to the extracellular milieu simply upon its entry into the E. coli periplasm once guided into this compartment by the LTB leader peptide. To test if extracellular secretion in this fashion might be extended to other disulfide bond-rich small peptides, the 13 amino acid conotoxin GI and a non-enterotoxic STa-related decapeptide were cloned. None of the two peptides was found in culture supernatants, in spite of high structural homology to the toxin. Failure to be secreted most likely leads to degradation as peptides were also not detected in bacterial sonicates. We hypothesize that cysteine-rich peptides must have an amino acid length and/or number of disulfide bridges closer to those in STa for them to follow this toxin secretory pathway in E. coli.