单碱基突变的检测

单碱基突变的检测吴学军,柴建华（复旦大学遗传所,上海２００４３３）关键词单碱基突变,检测在临床上有很多遗传病是由基因内的单碱基替换所致。如何快速简便地进行检测,发现这种点突变,是临床医学家的需要。１．单碱基检测方法的回顾用来检测单碱基错配的方法有等位...     

基于功率谱分析的基因编码序列单碱基突变研究

针对DNA序列单碱基的不同类型突变,利用数字信号处理方法,研究了单碱基替换突变、删除突变、插入突变对DNA序列三周期功率谱的影响。研究结果表明:对于不同长度的编码序列,替换突变对序列功率谱的影响较小,删除突变和插入突变对序列功率谱的影响较大;随着序列编码区长度的减小,替换、删除、插入突变对序列编码区的功率谱影响会越来越大。对于中等长度外显子,插入突变对序列三周期功率谱影响最大,对于短外显子,删除突变对序列三周期功率谱的影响最大。研究结果可为含突变基因编码区的识别与检测提供参考。     

基因编辑之“新宠”—单碱基基因组编辑系统

近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑。为进一步提高碱基修改的效率和精确度,2016年研究者们利用CRISPR/Cas9识别特定DNA序列的功能,结合胞嘧啶脱氨酶的生化活性发明了将胞嘧啶高效转换为胸腺嘧啶(C>T)的嘧啶单碱基编辑系统(base editor)。这一系统虽然能精准实现嘧啶直接转换,大大提高精确基因编辑效率,但美中不足的是无法对嘌呤进行修改。近期,Nature报道了将细菌中的tRNA腺嘌呤脱氨酶定向进化形成具有催化DNA腺嘌呤底物的脱氨酶,将其与Cas9系统融合发明了具有高效催化腺嘌呤转换为鸟嘌呤的新工具—腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs, adenine base editors)。本文总结了单碱基编辑工具的发展历程和最新研究进展,着重介绍ABEs的研发过程,并对单碱基编辑工具今后的应用方向和研发方向进行展望。     

CRISPR/Cpf1单碱基编辑系统的构建及应用

作物的优良性状往往来自于其相应基因的单个碱基突变,而传统育种无法轻易获得此种定向单碱基变异。单碱基编辑技术是以成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR?associated proteins,CRISPR/Cas）系统为基础改良的一项基因编辑技术,该技术可在不造成DNA双链断裂的情况下对靶序列上的特定碱基进行定向替换。为拓展单碱基编辑技术在作物中的识别范围,利用来自Francisella novicida细菌的FnCpf1核酸酶及胞嘧啶脱氨酶APOBEC1对单碱基编辑系统进行改良,并针对玉米BT2基因靶位点构建相应载体,通过瞬时转化手段检测其编辑能力。检测结果发现9种碱基变化类型,其中靶位点5′端第11个碱基的胞嘧啶转化为腺嘌呤,位点编辑效率达到2.5%。结果表明该系统能够识别“TTN”作为原型间隔序列毗邻基序（protospacer?adjacent motif,PAM）并对靶位点进行单碱基编辑,为单碱基编辑识别范围的拓展提供了研究思路。     

中国科学家发现胞嘧啶单碱基编辑工具存在 基因组范围的脱靶

基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一, 已经在人类(Homo sapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用。最近, 中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE) BE3和HF1-BE3, 以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(Oryza sativa)中的脱靶现象, 发现BE3和HF1-BE3两个CBE在全基因组范围内存在脱靶编辑, 而ABE则没有脱靶现象。这一发现对单碱基编辑工具的应用和进一步改进具有重要意义。     

中国科学家发现胞嘧啶单碱基编辑工具存在 基因组范围的脱靶

基于CRISPR-Cas的单碱基编辑工具是近2年基因组编辑技术的重大突破之一, 已经在人类(Homo sapiens)细胞和动植物中得到了验证与应用。最近, 中国科学家分析了胞嘧啶编辑器(CBE) BE3和HF1-BE3, 以及腺嘌呤编辑器(ABE)等单碱基编辑工具在水稻(Oryza sativa)中的脱靶现象, 发现BE3和HF1-BE3两个CBE在全基因组范围内存在脱靶编辑, 而ABE则没有脱靶现象。这一发现对单碱基编辑工具的应用和进一步改进具有重要意义。     

单碱基编辑系统介导欧拉藏绵羊GDF9、FecB多胎基因的定点突变

本研究旨在利用单碱基编辑系统(single base editing system)实现欧拉藏绵羊成纤维细胞FecB和GDF9基因靶位点A到G和C到T的碱基替换并检测其编辑效率。首先设计合成靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA序列,再分别连接至epi-ABEmax、epi-BE4max质粒,构建载体并电转至欧拉藏绵羊成纤维细胞,最后对阳性细胞FecB和GDF9基因进行Sanger测序鉴定靶位点突变结果,并通过T-A克隆估算单碱基编辑系统的编辑效率。结果显示获得了靶向欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因的sgRNA,并构建使欧拉藏绵羊FecB和GDF9基因单碱基突变的载体,FecB基因靶位点编辑效率为39.13%,GDF9基因靶位点(G260、G721、G1184)编辑效率分别为10.52%、26.67%和8.00%。本研究运用单碱基编辑系统在欧拉藏绵羊成纤维细胞上实现了FecB和GDF9基因靶位点突变,为改良欧拉藏绵羊一胎多羔的繁殖性状奠定理论基础。     

基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术

遗传性变异是表型多样性的基础,靶向饱和突变作物基因可以促进产生具有优异农艺性状的突变体。相较于传统诱变育种和异源物种中的定向进化方法,基于双碱基编辑系统的植物基因靶向随机突变技术可对植物内源基因产生高效突变,从而实现原位定向进化,加快植物育种及功能基因研究进程。该文介绍了使用饱和靶向内源基因突变编辑器(STEME)对植...     

VersusSNP:一种单碱基突变的筛选及分类工具

单碱基突变的筛选和分类是SNP分析的基础。为解决手工进行突变位点挖掘工作的困难,编写了VersusSNP软件。它可以解析并过滤序列比对结果,并根据突变类型将位点加以分类,以图形界面呈现给用户。使用VersusSNP,用户可以直观地了解基因组中单碱基突变的情况。其程序及源代码可以从http://sourceforge.net/projects/versussnp下载。     

BEguider:一个单碱基编辑器sgRNA设计与编辑效率预测工具

单碱基编辑器是实用且高效的基因编辑工具,其编辑效率与单向导RNA(single guide RNA, sgRNA)序列的设计密切相关。目前单碱基编辑器sgRNA序列的设计缺少特定的法则,主要依靠经验和大量尝试完成。本研究基于卷积神经网络,开发了一个单碱基编辑器sgRNA序列设计工具BEguider。BEguider利用TensorFlow 2深度学习框架建立编辑效率预测模型,能够在人基因组范围内针对NGG PAM序列依赖的单碱基编辑器ABE7.10-NGG和BE4-NGG批量设计sgRNA序列,预测编辑效率。此外,通过整合Cas-OFFinder, BEguider能够提供对sgRNA脱靶情况的评估。利用BEguider设计sgRNA序列,有助于研究人员提高实验效率,节约实验成本。     

基于单碱基延伸标签反应的常见食源性致病菌基因芯片检测方法的建立

针对8种常见的食源性致病菌(金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7和空肠弯曲杆菌),建立了基于单碱基延伸标签反应原理的基因芯片检测方法。筛选和整合8种食源性致病菌基因组中的特异性序列和相应PCR引物,致病菌靶DNA片段被扩增和纯化作为单碱基延伸标签反应的模板,反应产物在DNA芯片上与探针进行杂交反应,然后通过扫描基片的荧光强度进行判断。实验结果表明,可采用基于单碱基延伸标签反应的基因芯片方法同时特异性检测8种食源性致病菌,基因组DNA多重检测灵敏度可达到0.1pg,以鼠伤寒沙门氏菌为单一检测对象的细菌纯培养物灵敏度可达到5×102CFU/mL。本方法可以快速灵敏地检测食源性致病菌,为食源性疾病的诊断和防治提供了一个有效的方法。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于基因编辑技术的非人灵长类动物模型构建

非人灵长类疾病模型在生命科学和生物医药领域具有非常重要的地位。近年来,随着经典的靶向核酸酶(ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9)基因编辑技术的出现,科学家已经成功获得了多种人类疾病相关的非人灵长类模型。该文首先介绍了经典基因编辑技术和以此为基础开发的单碱基编辑(base editing, BE)以及先导编辑(prime editing, PE)技术的研究进展,随后对近年来通过不同基因编辑技术获得的非人灵长类疾病模型进行了综述,最后对目前已获得的和正在构建的非人灵长类模型的管理、保种以及动物伦理和福利等方面进行了展望。     

BE-dot：为单碱基编辑设计sgRNA及预测脱靶图谱的工具

目的 单碱基编辑器作为修复基因组点突变的有力工具，在生物技术开发和临床应用中具有极大潜力。对于目标改造的单核苷酸变异（SNV），首先要选择可用于编辑的单碱基编辑器（base editors，BEs）和单向导RNA（single guide RNA，sgRNA）。目前，尽管有较多工具实现了设计sgRNA，但缺少将设计sgRNA与评估单碱基编辑器特异性完整结合起来的工具。方法 纳入主流的27种胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和12种腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）对SNV设计编辑方案，并通过调用第三方工具BE-Hive对编辑方案进行效率预测。综合使用多个脱靶预测工具对编辑方案的脱靶图谱进行评估。最后结合BEs类型和脱靶位点，分析得到所有可能的脱靶编辑产物，再调用ANNOVAR这一变异注释工具进行脱靶产物的功能分析。结果 本文提出了一个综合性工具BE-dot，它可以实现对目标编辑的SNV从设计sgRNA到预测脱靶图谱的完整过程，并对脱靶产物进行功能注释。利用密码子的简并性，BE-dot除了提供DNA水平上的精确校正方案，还可以在蛋白质水平进行同义校正。在对单碱基编辑系统做脱靶图谱的预测时，BE-dot综合了Cas-OFFinder、CALITAS、CFD、uCRISPR、BEdeepoff等多个工具，可以更全面地评估单碱基编辑系统的特异性，为用户选择BEs和sgRNA提供参考。此外，BE-dot可以自动分析得到脱靶位点处所有可能的编辑产物，并转换为avinput格式供ANNOVAR进行功能注释，避免了以往手工注释的繁琐。结论 BE-dot能为单碱基编辑技术应用于纠正或引入SNV设计编辑方案，并且能够从编辑效率、脱靶图谱、脱靶带来的功能影响等方面对编辑方案进行全面的评估。     

胞嘧啶单碱基编辑技术与λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株的比较研究

由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。[目的] 以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术（CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE）和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。[方法] 采用PCR、Golden Gate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。[结果] 经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。[结论] CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。     

Rett综合征相关基因MeCP2敲除大鼠模型的构建及分析

MeCP2(Methyl CpG binding protein 2)基因突变可导致Rett综合征(Rett syndrome, RTT)。目前已报道的MeCP2敲除小鼠表型与RTT病人症状存在显著差异。为探索MeCP2在脑发育中的作用及其导致RTT的机制,本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了MeCP2基因敲除大鼠模型。通过构建靶向敲除MeCP2基因的载体,体外将Cas9 mRNA和sgRNA显微注射到SD大鼠受精卵中,在MeCP2基因exon2中造成移码突变,从而获得MeCP2基因敲除大鼠。利用测序和Western blotting方法鉴定MeCP2敲除大鼠,并对其表型和行为学特征进行分析,发现MeCP2敲除大鼠体重降低,存在焦虑倾向和认知缺陷。本研究成功构建了MeCP2基因敲除大鼠模型,其表型类似人类RTT患者的症状,为后续MeCP2功能研究提供了更好的动物模型。     

野生及笼养猕猴SV40T抗原基因检测方法的建立

目的建立猴外周血单核细胞SV40DNA的PCR检测方法,对猕猴SV40T抗原基因进行检测。方法使用PCR方法对分别来自野外（云南宁蒗71只、景东60只）及笼养猕猴（64只）的SV40大T抗原基因进行检测,同时对扩增出的阳性结果进行测序。结果在195份样本中,有4只来自野生猴样本扩增出SV40大T抗原基因（3．1％,4／131）,1只来自笼养猴样本扩增出SV40大T抗原基因（1．6％,1／64）。测序结果显示：猴血样本扩增片段序列与GenBank中的SV40大T抗原C-末端的基因序列片段有15个核苷酸不同（3．3％差异）,与SV40．776标准株的序列基本一致,但SV40—776在nt3020处有一缺口。结论云南野生及笼养猕猴猴群均能检出SV40T抗原基因。因此建立SV40病毒的DNA检测技术,对用于科研及疫苗生产的实验猕猴的病毒学质量控制具有重要意义。     

RT-SHIV rt基因单拷贝PCR扩增方法的建立及初步应用

目的建立RT-SHIV病毒全长rt基因单拷贝PCR扩增方法,用于HIV-1 rt基因体内遗传与变异研究。方法 Oligo软件设计RT-SHIV rt基因特异性扩增引物,梯度稀释方法进行特异性和灵敏度筛选,进而优化退火温度和PCR反应最佳循环数等条件,建立rt基因PCR扩增方法;在此基础上将模板进行有限稀释,摸索rt基因单拷贝PCR扩增条件;使用该方法扩增感染猴体内RT-SHIV病毒rt基因,BioEdit软件进行基因序列分析。结果筛选得到一组巢式PCR引物,成功建立了RT-SHIV rt基因PCR扩增方法;当模板浓度为100 copies/μL时,扩增产物为单拷贝序列;测序结果显示RT-SHIV感染猴d266和d294血浆样本分别存在1处和6处氨基酸突变。结论本研究建立的全长rt基因单拷贝PCR扩增方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可以应用于各类RT-SHIV病毒的全长rt基因分析。     

枯草杆菌碱性蛋白酶Ki 2基因的序列测定及M222A定点突变

含有枯草杆菌碱性蛋白酶Ｋｉ-２基因的１.９ｋｂＤＮＡ片段用限制酶切成几个小片段,将这些片段分别插入Ｍ１３ｍｐ１８或Ｍ１３ｍｐ１９中,用通用测序引物测得全序列。所得全序列与蛋白酶Ｅ相比较,在结构基因部分仅有８个碱基不同,由此而导致两个氨基酸的差异。此１.９ｋｂ的片段插入枯草杆菌大肠杆菌穿梭质粒Ｐｂｅ-２,得到的重组质粒转化蛋白酶缺陷型的枯草芽孢杆菌ＤＢ１０４,结果表明枯草杆菌碱性蛋白酶Ｋｉ-２基因在ＤＢ１０４中能利用自身的调控元件表达并分泌到胞外。将Ｋｉ-２蛋白酶的２２２位甲硫氨酸突变成丙氨酸,突变后的Ｋｉ-２蛋白酶具有抗氧化性,但比活性比野生型的约低１倍