尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生

目的: 通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性。方法: 基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(ΔFolprp4)。构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验。结果: 与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状。敲除突变体的另一个显著变化是ΔFolprp4的分生孢子产量显著下降。侵染实验表明,ΔFolprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低。互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株。结论: Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关。     

尖孢镰刀菌古巴专化型胱硫醚γ-合成酶的功能分析

甲硫氨酸在真菌、细菌和植物的生物学过程中起着重要作用。禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的FgMETB基因编码一个胱硫醚γ-合成酶,是甲硫氨酸合成所必需的。本研究利用同源重组的方法,在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace4(Foc4)获得了FgMETB同源基因FoMETB的敲除突变体菌株;与野生型菌株相比,突变体菌株ΔFoMETB在以SO42-为唯一硫源的基本培养基(minimal medium)上不能生长。1 mmol/L甲硫氨酸的添加恢复了突变体菌株ΔFoMETB的生长,但半胱氨酸的添加不能恢复该缺失突变体的生长,说明FoMETB的敲除阻遏了Foc4半胱氨酸转化甲硫氨酸的通路。此外,ΔFoMETB的气生菌丝和菌丝干重明显减少、分枝增多、产孢量显著降低、疏水性缺失和对巴西蕉组培苗的致病性显著减弱。由此表明,FoMETB参与调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生理特性和致病性,甲硫氨酸合成途径的关键合酶FoMETB有望成为新的抗真菌药物靶标。     

尖孢镰刀菌四个专化型细胞核的初步研究

本文对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的4个专化型12株菌的孢子萌发、核分裂时间及核DNA含量进行了比较,结果表明:不同专化型菌株孢子萌发速度基本一致,而萌发过程中发生第一次核分裂的时间不同。黄瓜、西瓜、荸荠、大豆各专化型第一次核分裂时间分别为:5.67hr、5.45hr、7.35hr、7.82hr,其核DNA含量分别为:0.321pg、o.306pg、0.177pg 0.174pg。测定结果显示出不同专化型菌株的孢子核DNA含量可能存在倍数关系,并推测F.oxysporum的黄瓜专化型与西瓜专化型为同一类型,而荸荠专化型与大豆专化型为同一类型。     

尖孢镰刀菌古巴专化型MAPK FoSlt2敲除突变体的转录组分析

尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（FOC）是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）FoSlt2信号通路在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育、细胞壁完整性和致病性方面发挥着重要作用。为了揭示FoSlt2信号通路的致病机理和寻找农药靶标,本研究利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和FoSlt2敲除突变体菌株的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 164个,其中上调表达基因有1 184个,下调表达基因有980个。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,差异表达基因主要参与在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学通路中。KEGG 功能富集分析结果表明,差异基因主要参与戊糖和葡糖醛酸盐转换、氨基糖和核苷酸糖、氨基葡聚糖降解、磷酸肌醇和碳类物质代谢通路,说明这些通路与尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育和致病性相关。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型致病机制的阐明奠定了理论基础。     

Folpcs1基因对尖孢镰刀菌亚麻专化型的无性繁殖和营养生长的调控

背景:尖孢镰刀菌亚麻专化型[Fusarium oxysporum Schl. f. sp. Lini (Bolley) SnyderHansen]是一种引起亚麻枯萎病的土传真菌,对亚麻的产量及质量有严重的危害。研究表明,在小麦赤霉菌中C2H2型锌指转录因子Pcs1调控中间瓶梗(intercalary phialides)产生分生孢子。目的:鉴定pcs1同源基因Folpcs1在镰刀菌中的作用。方法:对Folpcs1的基因组DNA及cDNA测序后,利用Split-Marker基因敲除技术破坏该基因。构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。通过聚乙二醇(PEG)转化野生型原生质体法,获得了Folpcs1基因缺失突变株(ΔFolpcs1),并利用PCR法进行正负筛选。为了对缺失突变体互补,将pcs1及其上下游侧翼序列构建到pZWH1中后,回复到ΔFolpcs1中。结果:测序结果表明,有一个654bp的内含子,cDNA序列长度为2 846bp。通过观察发现,敲除突变体的生长速率明显降低,培养基中几乎观察不到分生孢子。回复突变体回复了野生型菌株的生长速率及分生孢子产生过程。结论:说明Folpcs1负责菌丝的营养生长和分生孢子的产生。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

尖孢镰刀菌致病机理和化感作用研究进展

尖孢镰刀菌引起的枯萎病在生产中的防控相当困难。通过总结国内外相关文献,综述近年来有关尖孢镰刀菌致病机理和化感作用的研究进展。尖孢镰刀菌通过分泌毒素和细胞壁降解酶共同致病,谱系特异性区域的存在是其致病性强和宿主范围广的主要原因;在尖孢镰刀菌各专化型中已分离出大量致病相关基因;其他植物和拮抗微生物(木霉菌、丛枝菌根真菌、非致病性尖孢镰刀菌以及植物生长促生菌)可以分泌化感物质,作用于宿主植物和尖孢镰刀菌,直接抑制尖孢镰刀菌的生长或激活宿主植物的防御反应。未来有关尖孢镰刀菌致病机理研究应该在基因组测序基础上构建精细的遗传图谱;对化感作用的研究应当深入探讨分子机理,利用高通量测序等技术在转录组或蛋白组水平上明确宿主植物抗枯萎病相关基因,同时利用分子标记辅助育种来筛选新的抗枯萎病品种。     

月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌抑制作用的研究

采用生长速率法和孢子萌发法分别测定月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率,显微观察总黄酮处理尖孢镰刀菌后菌丝体形态结构的变化,并测定菌丝体相对电导率,菌丝体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明:月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用,抑制率随总黄酮浓度增加而增高,20 mg/L时抑制率达100%。总黄酮处理后的尖孢镰刀菌菌丝较细,分支减少,透明度差,液泡数量增多且形成较大的液泡;菌丝体细胞膜透性增加,SOD、CAT活性呈先上升后下降的趋势。以上实验结果可为植物病害生物防治及开发植物源农药方面提供理论依据和实验技术。     

嫁接西瓜对西瓜枯萎病菌侵染的防御机制研究

为了揭示嫁接提高西瓜抗枯萎病的机制,该研究以嫁接西瓜为材料,采用扫描电镜观察了枯萎病菌侵染下寄主的组织结构变化,荧光定量分析了相关防卫基因的表达,比较了嫁接西瓜对枯萎病菌侵染的抗感反应。结果显示:(1)枯萎病菌侵染后,与自根西瓜相比,嫁接西瓜的根部木质部导管通过快速形成膜状物、侵填体及细胞壁增厚阻塞菌丝入侵;自根西瓜防御反应较嫁接西瓜晚,严重侵染时薄壁细胞降解,导管组织脱落导致维管系统空洞,从而使植株呈现萎蔫症状,该现象在嫁接西瓜中没有发现。(2)枯萎病菌侵染后,嫁接西瓜比自根西瓜具有较高的防卫基因表达水平,其中:嫁接西瓜中,CHI、APX和PPO基因的表达随枯萎病菌侵染时间的延长而升高,而PAL呈现先升高后降低的表达趋势,但仍高于本底表达;自根西瓜中,仅PPO基因在枯萎病菌侵染后表达上调,而其他基因的表达则是先升高后降低,与嫁接西瓜中的PAL基因表达一致。研究表明,嫁接植株一方面通过快速的组织结构响应,另一方面从转录水平提高了相关防卫基因的表达,最终使植株具有抗病性;推测防御基因在嫁接植株与枯萎病菌互作中的强烈诱导响应可能是嫁接植株抗病的分子机制之一。     

大豆根瘤内抗棉花枯萎病菌株的筛选及其防病试验

【目的】采用优良抗病性内生菌资源来控制棉花枯萎病是一种有效的措施。本研究从大豆根瘤中筛选棉花枯萎病拮抗性内生细菌,探索其对棉花枯萎病菌丝的抑制作用和代表菌株特性,为发掘和应用防病、抗逆优良菌株提供理论基础。【方法】采用对峙法和代谢液培养法对大豆根瘤内生细菌进行棉花枯萎病菌抑菌性筛选,显微观察法研究筛选菌株引起病原菌菌丝变化,通过菌株培养特征、理化特性和16S r DNA序列同源性分析确定菌株系统发育地位,比色法测定DD174耐盐碱性,盆栽试验验证防病效果。【结果】经复筛和代谢液试验有5株拮抗性较强菌株,被作用病原菌菌丝畸形、细胞壁消失、自溶,菌丝基部加粗、分支增多,呈树根状;菌丝被菌苔包埋而溶解、断裂,菌丝末端球形膨大。对棉花枯萎病菌的抑制作用主要通过菌体产生胞外代谢物发挥作用。菌株DD174、DD176和DD179最相似菌株分别为Bacillus oceanisediminis H2T(GQ292772)和B.thuringiensis ATCC 10792T(AF290545),菌株DD165和DD166最相似菌株均为Stenotrophomonas maltophilia LMG 958T(X95923)。DD174能耐受6%盐浓度,p H 10生长良好,具有一定耐盐碱能力。DD174处理组防治效果达76.32%,其他防效均在62%以上,可作为棉花枯萎病的生防菌株资源。【结论】大豆根瘤内存在棉花枯萎病内生拮抗细菌,其中有些菌株具有一定耐盐碱能力,对棉花枯萎病病原菌及病害有一定抑菌和防病作用。     

棉花抗枯萎病相关ERF-B3亚组转录因子的克隆与表达

以拟南芥ERF-B3亚组转录因子的AP2/ERF结构域为探针,利用NCBI中的棉花(Gossypium hirsutum)EST数据库,通过电子克隆结合RT-PCR方法,从枯萎病菌诱导后的高抗枯萎病品种‘中棉所12’克隆到1个与抗枯萎病相关的ERF-B3亚组转录因子基因GhB301。序列分析结果显示,GhB301基因cDNA全长593 bp,开放阅读框384 bp,编码127个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域。实时荧光定量PCR检测该基因的表达显示,枯萎病菌诱导后,GhB301基因在棉花根中、抗病品种中优势表达;在乙烯、水杨酸、干旱、低温及高盐的诱导下表达量均发生变化。研究结果表明,GhB301基因可能参与了棉花对病原菌、激素及非生物胁迫的应答反应。     

Purification and characterization of an exopolygalacturonase produced by Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici

Abstract An exopolygalacturonase produced by Fusarium oxysporum f. sp. radicis lycopersici , a fungus that produces root rot, was purified by gel filtration and ion exchange chromatography. It had a M _r 68 K, a pH optimum of 5.6 and an optimum temperature of 60°C. This polygalacturonase was inhibited by calcium ions and had a K _m of 0.64 mM using sodium polypectate as substrate. The exo mode of action of this enzyme was revealed by thin-layer chromatography of hydrolysed substrate.     

香蕉枯萎病菌4号生理小种致病相关基因foABC1的分离

通过对香蕉枯萎病菌4号小种致病突变体B1233的进一步研究,分离了被突变的致病相关基因foABC1,同源性分析及保守结构预测该基因编码一类ABC转运蛋白,其功能可能同稻瘟病菌的ABC转运蛋白一样,负责真菌毒素的泵出,或是像其他真菌的ABC转运蛋白,在病原菌侵染寄主植物时能忍耐植物因防卫反应所释放的植保素或抗毒素类物质。     

瓜类枯萎病菌遗传多样性和亲缘关系的SRAP分析

尖孢镰刀菌可造成不同瓜类的枯萎病.为明确不同寄主、不同地区的瓜类枯萎病菌菌株间的遗传多样性及亲缘关系,采用相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术,对来源于不同地区、不同寄主的95株尖孢镰刀菌的基因组DNA进行多态性扩增.以筛选出的19对引物共扩增出238条带,多态性比率为100%,平均每对引物扩增出12.5个位点和12.5个多态性位点;尖孢镰刀菌苦瓜专化型共扩增出166条带,其中145条为多态性条带,多态性比率为87.4%,平均每对引物扩增出8.7个位点和7.7个多态性位点,说明尖孢镰刀菌的遗传变异较为广泛.瓜类枯萎病菌株间的遗传相似系数范围为0.68～0.99,样品间的平均Nei遗传多样性指数和Shannon指数分别为0.2390和0.3718.在遗传相似系数为0.74时,可将供试的95株尖孢镰刀菌划分为苦瓜、黄瓜、西瓜、甜瓜4个专化群.在SRAP聚类树中,同一寄主的尖孢镰刀菌聚在一个分支上,其中尖孢镰刀菌苦瓜专化型菌株间的遗传相似系数范围为0.78～0.99,Nei遗传多样性指数为0.1811,平均Shannon指数为0.2750,表明尖孢镰刀菌苦瓜专化型的遗传变异较大,且菌株的聚群与地理来源存在相关性.     

芽孢杆菌B1、B2对豌豆尖镰孢菌抗菌机理的研究

同、异步培养结果表明：芽孢杆菌B1、B2对豌豆尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum Schl f．sp．pisi)有很强的抑菌作用。经B1、B2无菌液处理后的病原菌由灰白色变为白色,气生菌丝增多且纠结成团。抗菌显微特征是：导致病菌孢子和菌丝体膨大、畸形、原生质凝聚、孢子不萌发或萌发异常、菌丝生长点产生大量泡囊、生长受阻,后期菌丝体断裂、泡囊破裂、原生质外泄。B1、B2无菌液中蛋白含量分别为1795．53μg/mL和1345．93μg／mL,各含一种抗菌蛋白,其分子量分别为103．5kD(B1)和127．6kD(B2)。