稳定表达禽β防御素6的DF-1细胞系的建立及其抑菌活性

[背景]禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用.[目的]建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考.[方法]利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD...     

枯草芽胞杆菌fmbj SrfAC-A结构域的活性测定

[目的]在体外研究surfactin合成酶的A结构域,为获得新的surfactin类似物奠定基础.[方法]本文从枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)fmbj中克隆出surfactin合成酶第7个模块的A结构域基因(SrfAC-A),与表达质粒pET-23a相连后在大肠杆菌表达系统中表达,用Ni-NTA亲和柱对重组蛋白SrfAC-A进行分离纯化后测定其活性.[结果]克隆所得的A结构域对Ile有选择活性,而对其他氨基酸基本无活性.[结论]Surfactin合成酶中的A结构域能在体外独立行使其选择底物氨基酸的功能.     

限制性内切酶Mlu I蛋白及其硒代衍生物的制备

[背景]限制性内切酶Mlu I是一种常用的工具酶,在分子生物学领域发挥着重要的作用,其三维结构尚未被解析.[目的]在大肠杆菌中克隆表达、纯化重组Mlu I蛋白及其硒代蛋白,并进行结晶条件的研究.[方法]构建重组表达载体pET28b-Mlu I,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析...     

球形芽胞杆菌C3-41磷酸果糖激酶的克隆、表达及基本生物活性

[目的]球形芽孢杆菌缺乏EMP、HMP、ED途径的关键酶,如磷酸果糖激酶等被认为是其不能以糖类物质进行生长的主要原因.杀蚊球形芽孢杆菌C3-41全基因组序列分析表明,在染色体DNA上存在的磷酸果糖激酶基因pfk,为了进一步分析球形芽孢杆菌糖酵解途径,进一步确定磷酸果糖激酶在糖酵解途径中的功能.[方法]通过pfk基因在球形芽孢杆菌菌株中的Southern-blot拷贝数鉴定,在C3-41pfk基因克隆的基础上进行pfk基因在大肠杆菌中的融合表达、序列分析和序列比对等方法进行研究.[结果]证明了球形芽孢杆菌pfk基因由960 bp核苷酸组成,表达42 kDa的PFK融合蛋白,有保守的底物结合域和ATP结合域,同时pfk基因重组表达质粒可以回复大肠杆菌pfk缺陷型菌株DFl020代谢糖的能力.[结论]杀蚊球形芽孢杆菌C3-41的pfk表达产物具有磷酸果糖激酶活性,为今后深入研究球形芽孢杆菌产能代谢机理奠定了基础.     

我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株RNA聚合酶的表达与功能表征

[背景]诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的主要食源性病原体.目 前尚无获批的诺如病毒疫苗和药物,诺如病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)是当前抗诺如病毒药物开发的主要靶点.[目的]表达我国诺如病毒易重组基因型GII.P12/GII.3毒株的RdRp并系统地表征其复制特征.[方法]基于大肠杆菌系统表达并纯化得到高纯度可溶...     

产异丁醇关键基因在大肠杆菌中表达的研究

[目的]改造大肠杆菌缬氨酸合成途径,使其能够代谢合成异丁醇.[方法]将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) 1.2829的2-酮异戊酸脱羧酶基因(kivD)和醇脱氢酶基因(adhA)串联克隆到大肠杆菌DH5α宿主中表达.[结果]经过改造的宿主菌发酵24 h后异丁醇产量为0.12 g/L.酶活测定实验发现,kivD和adhA基因在宿主菌中均得到表达,但由于KivD的低表达量导致宿主菌最终的异丁醇合成能力偏低.通过研究温度和pH对KivD和AdhA酶活的影响,最终选定二者的最适温度为30℃,最适pH为6.5. [结论]通过向宿主菌导入外源异丁醇合成基因能够改造其自身代谢途径,从而合成异丁醇.     

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达

[目的]鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的克隆与表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列.[方法]从本实验室筛选的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062)发酵液中,分离纯化得到谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-MTGase),测得N-端前十个氨基酸序列并与其它链霉菌来源的相应基因序列比较设计引物,扩增得到pro-MTGase 基因,将该基因插入到表达载体pET-20b( )信号肽pelB下游,构建分泌型表达载体pET/pro-MTG,并转化不同的大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS.[结果]获得了pro-MTGase的完整基因序列,多重碱基序列比对表明其与S.platensis和S.caniferus的pro-MTGase基因同源性高达92%.利用Rosetta(DE3)pLysS通过降温至24℃诱导策略,获得部分胞外表达的酶原.SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原相符.诱导4 h后发酵液中的重组酶原经胰蛋白酶活化为成熟酶后测得最高酶活为0.24U/mL.[结论]该研究是对吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的首次报道,也是国内首次利用大肠杆菌实现pro-MTGase的胞外可溶性表达.     

基因atpA、purHD和ndh的过量表达对大肠杆菌DH5α生长的影响

[目的]理解大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在基本培养基中生长和乙酸积累差异的机理.[方法]根据前期针对两个菌株蛋白质组和培养中物料及能量平衡的分析,通过PCR分别扩增大肠杆菌DH5α及DA19的atpIBEFHAGDC基因、purHD基因和与NADH氧化代谢相关ndh基因及其各自的调节区,以及NADH脱氢酶Ⅰ基因(nuoA-N)的调节区.将atpA、purHD和ndh基因分别克隆到载体pTrc99a中,转化DH5α,研究基因过量表达对生长的影响.[结果]测序结果表明两个菌株的这些DNA序列与公布的大肠杆菌K-12的相应序列完全一致,在DH5α菌株中分别过量表达atpA、purHD或ndh基因可以在一定程度上改善菌体的生长.[结论]过量表达purHD或ndh基因比过量表达atpA基因的效果更好,但与DA19的生长相比仍然存在较大差距,反映了代谢全局调节的重要性.     

钝齿棒杆菌溶氧诱导型启动子的筛选及其功能验证

[目的]筛选钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5内源溶氧诱导型启动子,验证其在不同溶氧条件下受溶氧调控的功能.[方法]以本课题组前期利用双向电泳结合质谱鉴定技术分离鉴定出的高低供氧条件下钝齿棒杆菌SYPA5-5胞内的显著差异蛋白(27个)为基础,结合棒杆菌基因组信息分析高低溶氧状态下显著差异蛋白中单位拷贝的表达量,以其中单位拷贝表达量高的蛋白为目的蛋白,克隆目的蛋白编码基因的上游启动子,分别替换棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pDXW-8的外源tac启动子,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中表达报告基因gfp和cat,并检测其表达效率.[结果]筛选出高溶氧上调蛋白转酮醇酶和延胡索酸水化酶作为目的蛋白,克隆其启动子区命名为P-tkt和P-fum.在重组大肠杆菌和重组钝齿棒杆菌中,P-tkt在高溶氧条件下CAT活性是低溶氧条件下CAT活性的2.8和3.2倍.该结果在5L发酵罐中得到验证.[结论]启动子P-tkt为首次筛选到的钝齿棒杆菌内源性高溶氧诱导型启动子,适用于高溶氧条件发酵生产氨基酸的菌株中,有利于在高供氧条件下提高棒杆菌中氨基酸的合成代谢能力.     

黄芩苷铝胁迫下产肠毒素大肠杆菌内参基因的筛选

[背景]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是导致仔猪腹泻的主要致病菌之一,黄芩苷铝对ETEC诱导的仔猪腹泻具有良好的治疗效果,但作用机制尚不明了.[目的]筛选出黄芩苷铝胁迫下ETEC中表达水平最为稳定的内参基因.[方法]采用qPCR技术测定了 12个内参基因 ...     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。     

Optimizing expression and purification of an ATP-binding gene gsiA from Escherichia coli k-12 by using GFP fusion

The cloning, expression and purification of the glutathione (sulfur) import system ATP-binding protein (gsiA) was carried out. The coding sequence of Escherichia coli gsiA, which encodes the ATP-binding protein of a glutathione importer, was amplified by PCR, and then inserted into a prokaryotic expression vector pWaldo-GFPe harboring green fluorescent protein (GFP) reporter gene. The resulting recombinant plasmid pWaldo-GFP-GsiA was transformed into various E. coli strains, and expression conditions were optimized. The effect of five E. coli expression strains on the production of the recombinant gsiA protein was evaluated. E. coli BL21 (DE3) was found to be the most productive strain for GsiA-GFP fusion-protein expression, most of which was insoluble fraction. However, results from in-gel and Western blot analysis suggested that expression of recombinant GsiA in Rosetta (DE3) provides an efficient source in soluble form. By using GFP as reporter, the most suitable host strain was conveniently obtained, whereby optimizing conditions for overexpression and purification of the proteins for further functional and structural studies, became, not only less laborious, but also time-saving.     

异源表达的幽门螺杆菌cag4蛋白有溶菌糖基转移酶活性

摘要【目的】构建融合基因原核表达载体pET-28a- cag4,并表达重组融合蛋白cag4,分析重组融合蛋白的酶活性,为新型抗生素（或是抗菌药物）的研发提供作用靶位。【方法】本研究利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a- cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌 BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。【结果】在大肠埃希菌 BL21(DE3)中获得高效表达的重组蛋白; 经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化,并进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析,表明目的蛋白具有明显的肽聚糖水解活性; 通过监测浊度下降速率,比较其在不同pH条件下活性的变化,即?A/（min?mg protein）,结果表明,幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。【结论】幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

将人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（hTNFR1）基因克隆到pET-22b表达载体,成功构建了重组表达质粒pETH1,电转到Escherichia coli BL21（DE3）表达菌株中进行摇瓶发酵。实现了hTNFR1在大肠杆菌表达系统中的重组表达。但目的蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高hTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达,融合标签和分子伴侣两种策略被实施用于辅助hTNFR1的可溶性表达。结果表明,在hTNFR1的N端融合NusA标签后,hTNFR1的可溶性有一定提高;在NusA-hTNFR1基础上,过表达了7种分子伴侣,筛选出tig分子伴侣对hTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用,可溶性表达量约占总量的90％;对优化后的hTNFR1表达系统的可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶酶切去除N端的NusA标签,结合Western blot分析鉴定,获得了大量高纯度的hTNFR1蛋白。研究结果为进一步研究hTNFR1的生理学活性及其在疾病治疗方面的应用奠定了良好基础。     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。