鹤望兰类黄酮3′,5′-羟化酶基因SrF3′5′H的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类黄酮生物合成途径关键基因SrF3′5′H。该cDNA全长1 766 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 509个碱基,编码503个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,SrF3′5′H编码的氨基酸序列与已报道的其他植物的F3′5′H蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰SrF3′5′H与非洲紫罗兰蛋白亲缘关系较近。应用半定量PCR分析表明,SrF3′5′H在始花期转录水平达到最高,且在蓝色花瓣中表达最高,在黄色花萼中几乎没有表达。     

藤茶黄烷酮3-羟化酶基因AgF3H的克隆及表达分析

该研究以藤茶叶片为材料,利用RACE技术克隆得到1个黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因,命名为AgF3H(登录号为JX087441)。AgF3H基因的cDNA全长为1 323 bp,其中开放阅读框长1 092 bp,编码363个氨基酸,含有双加氧酶家族的2个特征性结构域和5个保守基序。序列比对与系统进化树分析显示,AgF3H与其他物种F3H的氨基酸序列具有较高的相似性,且与葡萄、山葡萄和圆叶葡萄的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,AgF3H基因在藤茶不同组织部位都有表达,在芽中的表达量最高,嫩茎中最低,在叶片中的表达量随着成熟度的增加而逐渐降低;不同组织中的AgF3H基因表达量与藤茶类黄酮主要成分二氢杨梅素的含量呈显著正相关。构建AgF3H基因过表达载体并导入烟草中,获得5株转基因植株,其中4株烟草的叶片总黄酮含量比野生型对照有不同程度提高,最高株系提高了26.8%。研究表明,AgF3H基因可能在藤茶类黄酮的生物合成中起重要作用,研究结果为进一步研究藤茶高黄酮含量形成的分子机制奠定了基础。     

芜菁的类黄酮3'羟化酶基因克隆和UV-A诱导表达特性

用UV-A处理'津田'芜菁和'赤丸'芜菁块根24 h后提取总RNA,以RT-PCR方法分别克隆到BrF3'H1和BrF3'H2基因.BrF3'HI和BrF3'H2的开放读码框为1 536 bp,均编码511个氨基酸.氨基酸序列分析显示,BrF3'Hl和BrF3H2与甘蓝型油菜F3tH的同源性达99%.在第45～476的肽段含有细胞色素P450家族基因的结构域.BrF3HI和BrF3'H2基因有高度同源性,核苷酸序列的17个位点处有差异,推导的氨基酸序列在5个位点处有差异.Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3HI表达,基因的表达量与UV-A处理时间呈相关,UV-A不能诱导BrF3'H2基因表达.     

梅花类黄酮3'-羟化酶基因片段基于基因组DNA的简并PCR法克隆

用本研究设计的"预先去杂-SDS法"从梅花嫩叶提取到高质量的基因组DNA.根据11条已公开发表的并提交到GenBank的类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的假定氨基酸序列的保守区设计2个正向简并引物和3个反向简并引物组成6对引物,仅有1对引物能以PCR法同时从梅花'南京红须'、'南京红'和'粉皮宫粉'的基因组DNA扩增到一个469 bp的核苷酸片段,这3个片段在总体上有99.72%的一致性,与11条类黄酮3'-羟化酶基因cDNA的相应区域有65.57%的一致性.同时,"GGEK"并非类黄酮3'-羟化酶的特征性模体.这是首次从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3'-羟化酶基因片段.本研究结果可为梅花类黄酮3'-羟化酶基因全长的克隆奠定基础.     

高丛蓝莓类黄酮3′-羟化酶基因F3′H的克隆及表达特性分析

以高丛蓝莓(Highbush blueberry)"喜来(Sierra)"和"日出(Sunrise)"为研究材料,通过RACE(rapid amplification of c DNA end,RACE)技术获得蓝莓(Vaccinium ssp.)F3′H基因的全长c DNA序列,并使用生物信息学工具对该基因编码蛋白的氨基酸组成及理化性质、二级和三级结构,以及氨基酸序列的相似性等进行了预测和分析。利用荧光定量PCR(RT-q PCR)手段来检测其在蓝莓果实不同发育时期表达情况。结果表明:Vs F3′H全长c DNA为1 871 bp,编码530个氨基酸,蛋白相对分子质量为58.33 k D,理论p I值为7.32;蛋白疏水性指数为0.004,属于疏水性蛋白,二三级结构预测可知其富含α-螺旋和无规则卷曲。RT-q PCR发现Vs F3′H主要在果实发育前期表达量较高,蓝果期表达量明显下调,且在不同品种中以蓝果期的表达量差异显著。这些研究结果为解析蓝莓果实色泽发育及果树分子育种奠定了理论基础。     

紫茎泽兰hsp90和hsp17.66基因启动子的克隆及其序列分析

以入侵植物紫茎泽兰(Ageratina adenophora Sprengel)为材料,采用基于PCR方法的染色体步行和改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)两种方法分别克隆到hsp90和hsp17.66基因的5'上游启动子序列,长度分别为864 bp和1 485 bp(GenBank登录号分别为FJ434253和FJ434252).测序结果表明:这两个启动子序列均具有hsp启动子特有的HSE元件,及其他一些启动子顺式作用元件,如TATA-box,CAAT-box等.     

植物类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因的研究进展

本文介绍了植物F3’日基因的克隆、序列分析、表达分析、系统进化及转录调控的研究进展。     

薇甘菊乙醇酸氧化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

利用SSH和RACE相结合的方法获得了薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长,并对该序列进行了生物信息学分析。随后将该基因的cDNA编码区克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒,转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行表达。序列分析表明,薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长1 363 bp,编码369个氨基酸,命名为MmGO（GenBank登录号EU716626）,推测的MmGO分子量为40.32 kDa,等电点为8.99。系统进化分析表明,MmGO与芸苔的GO序列亲缘关系比较近。将该基因重组到pET-32a(+)中进行原核表达,经0.1 mmol·L^-1 IPTG,25℃诱导4 h,获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His MmGO,Western-blot证实表达的6×His-MmGO能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为60 kDa,与预测的融合蛋白6×His-MmGO分子量相符。为进一步研究融合蛋白6×His-MmGO的活性和功能奠定了基础。     

3种本地植物与入侵植物紫茎泽兰的竞争

为筛选替代控制紫茎泽兰的本地植物及探讨提高替代控制效率的方法,通过盆栽实验并利用相对产量(RY)和竞争攻击力系数(A)衡量了3种本地植物与紫茎泽兰的竞争关系,同时评估了活性炭(AC)、杀真菌剂(FC)和二者联合(AC+FC)对它们竞争的影响。结果表明：(1)不添加任何物质条件下：紫茎泽兰与南酸枣混种时,紫茎泽兰的生物量明显高于单种(P<0.05),其RY和A分别显著大于1和0(P<0.05);紫茎泽兰分别与假地豆和狗尾草混种时,紫茎泽兰的株高和生物量均明显低于单种(P<0.05),其RY和A均分别显著小于1和0(P<0.05)。说明紫茎泽兰的竞争力强于南酸枣而弱于假地豆和狗尾草,假地豆和狗尾草可以在一定区域作为替代控制紫茎泽兰的潜在目标植物。(2)与不添加任何物质相比,紫茎泽兰与南酸枣混种时,AC、FC及AC+FC处理增加了紫茎泽兰的根冠比,降低了其地上生物量比,也降低了南酸枣的生物量(P<0.05);紫茎泽兰与假地豆混种时,AC和AC+FC处理增加了假地豆的株高和生物量,FC处理增加了紫茎泽兰的株高(P<0.05);紫茎泽兰与狗尾草混种时,AC和A...     

葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因的克隆,序列分析及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法把葡萄扇叶病毒(GFLV)外壳蛋白基因(CP gene)分成两部分扩增,扩增产物克隆入pGEM-5Zf(+)载体,并通过BglⅢ位点连接成一完整的外壳蛋白基因,通过序列分析测得全长外壳蛋白基因为1512bp,编码504个AA＇s,与国外株系GFLV-F13相比,核苷酸同源性为88.4％,氨基酸同源性为95.8％。并且这一外壳蛋白基因在大肠杆菌E.coli DH-5α中得到了表达。     

紫茎泽兰花蕾发育过程中类Beclin1基因的克隆表达分析

以紫茎泽兰不同发育时期花蕾为实验材料,通过光学显微观察、DNA ladder检测表明紫茎泽兰花蕾发育过程中绒毡层有PCD现象发生,自紫茎泽兰花蕾中克隆长为679 bp的Beclin1 cDNA基因部分片段,同烟草叶片的Beclin1基因序列（AY701316）同源性为98%,通过Northern blotting分析,在紫茎泽兰花蕾发育过程中细胞程序性死亡（PCD）相关Beclin1基因表达在花蕾发育第Ⅱ期和Ⅲ期较为旺盛,且在花蕾发育第Ⅱ期最强烈。本研究首次克隆并证实紫茎泽兰花蕾Beclin1基因与PCD有一定的相关性,为分析紫茎泽兰入侵机理提供新的思路和手段。     

酵母pac—1基因的克隆、序列分析和在大肠杆菌中的高效表达及活性测定

粟酒裂殖酵母菌 (Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ)的 ｐａｃ 1基因于 1991年Ｙｕｉｃｈｉｌｉｎｏ等首次报道。在温度敏感型的酵母突变体中 ,ｐａｃ 1基因是一个多拷贝阻遏子 ,它使酵母在限制温度培养条件下的减数分裂不受调控 ,对酵母的生长过程起着重要的调节作用。该基因有一个编码 36 4个氨基酸的开放阅读框 ,编码产物的羧基端与大肠杆菌核糖核酸酶Ⅲ有2 5 %的同源性。通过酶活性测定 ,已经确定它是一类依赖ｄｓＲＮＡ的核糖核酸酶 ,具有降解ｄｓＲＮＡ的功能[1,2 ] 。由于大多数植物病毒为ＲＮＡ病毒 ,因此无论它的基…     

Cloning, Sequence, and Expression of the Phosphofructokinase Gene of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 in Escherichia coli

The pfk gene encoding phosphofructokinase (Pfk) from the anaerobic bacterium Clostridium acetobutylicum ATCC 824 was cloned and sequenced. The gene was identified in a plasmid library by complementation of an E. coli pfk mutant and by the ability to amplify a fragment by PCR using primers based on homologous regions of Pfk from other microorganisms. Nucleotide sequence analysis revealed a coding region for a 319-aa protein homologous to Pfks from other organisms. Enzyme assay and ability to complement the growth defects of E. coli pfk mutants confirmed the expression of the clostridial pfk gene. The pyruvate kinase (pyk) gene was identified adjacent to pfk. Such an arrangement for the genes encoding key regulators of glycolytic flux had not yet been described in a strict anaerobe. This gene arrangement has been found in other Gram-positive organisms, but not in Gram-negative organisms. Reveived: 15 September 1997 / Accepted: 12 January 1998     

转谷氨酰胺酶基因在大肠杆菌中的克隆表达

从轮枝链霉菌Streptoverticilliummobaraense细胞中获得其基因组DNA ,用一对特异性的引物通过PCR的方法扩增出转谷氨酰胺酶 (transglutaminase,TGase)全长基因 ,回收片段并将其连接到表达载体pET30a中 ,转化大肠杆菌DH5α。双向测序表明获得的转谷氨酰胺酶全长基因序列正确。纯化重组质粒转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,以 1mmol/LIPTG诱导 5h收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析 ,与阴性对照相比 ,明显多出了一条蛋白条带 ,紫外扫描显示此带约占总蛋白量的1 7% ,Westernblotting证实此带能够特异性地与兔抗MTG(味之素公司 )的抗体发生反应。测得纯化后得到的TGase蛋白的酶活可以达到 15.1U/mg蛋白。     

解毒酶基因的克隆及在大肠杆菌中的融合表达

用RT－PCR克隆了酯酶B1 5′端B1（a）,并对其者了序列测定,将其与3′端B1（b）一起连接到pET-28a中,构了完整融合表达载体pET-ESTB1。转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下,经过12小时,酯酶B1在大肠杆菌内的融合表达达到27％。通过纯化获得1条带的重组蛋白,用粗酶对马拉硫磷的降解显示,该解毒酶在15分钟即降解22.1％,具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力,为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等提供了新途径。     

酿酒酵母海藻糖合成酶基因的克隆和在大肠村菌中的表达

用PCR方法克隆了1．5kb的酿酒母Sacchromyces cerevisiae海藻糖合成酶基因TPSI,将该片段连接到pUC19载体,通过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌Escherichia coli FF4169 和FF4050,对转化株的质粒DNA酶切分析表明均含有1．5kb PCR克隆片段,生长曲线实验证明,带有克隆片段的转化株在含0．5mol/L NaCl的高渗透压基础培养基中生长良好;用高效液相色谱（HPLC）结合蒸发散射（ELSD）技术测定细胞内海藻糖实验证明转化株能够合成海藻糖。     

Cloning,Sequence Analysis,and Expression in Escherichia coli of the Gene Encoding Monovalent Cation-activated Levodione Reductase from Corynebacterium aquaticum M-13

The gene encoding (6R)-2,2,6-trimethyl-1,4-cyclohexanedione (levodione) reductase was cloned from the genomic DNA of the soil isolate bacterium Corynebacterium aquaticum M-13. The gene contained an open reading frame consisting of 801 nucleotides corresponding to 267 amino acid residues. The deduced amino acid sequence showed approximately 35% identity with other short chain alcohol dehydrogenase/reductase (SDR) superfamily enzymes. The probable NADH-binding site and three catalytic residues (Ser-Tyr-Lys) were conserved. The enzyme was sufficiently produced in recombinant Escherichia coli cells using an expression vector pKK223-3, and purified to homogeneity by two-column chromatography steps. The enzyme purified from E. coli catalyzed stereo- and regio-selective reduction of levodione, and was strongly activated by monovalent cations, such as K⁺, Na⁺, and NH₄ ⁺, as was the case of that from C. aquaticum M-13. To our knowledge, this is the first sequencing report of a monovalent cation-activated SDR enzyme.     

查尔酮合酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的高效表达

类黄酮是植物中的一种重要的次级代谢产物,它与植物的花色形成有关。查尔酮合酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶,在植物体内,ＣＨＳ表达量的增加或减少都可能改变花的。从矮牵牛花瓣的ｃＤＮＡ中克隆到了ＣＨＳ－Ａ基因,进行了全序列分析,并与国外已报道的ＣＨＳ－Ａ－序列进行了同源性比较。