人Pescadillo诱导大规模染色质伸展

人Pescadillo基因编码的蛋白分子中含有一个BRCT结构域, Pescadillo在DNA合成、细胞增殖和转化中发挥重要作用. 考虑到BRCT结构域能够诱导大规模染色质伸展, 对Pescadillo在大规模染色质伸展中的作用进行了研究. 首先从人乳腺MCF10A细胞中得到了Pescadillo编码区的cDNA, 其序列在第580~582位氨基酸发生缺失, 将该cDNA 片段与lac阻遏物在AO3-1细胞中融合表达, 通过lac阻遏物结合细胞基因组中含有lac操纵基因的区域将Pescadillo靶向至染色质周围, 发现Pescadillo能够诱导大规模染色质伸展, 并将诱导大规模染色质伸展活性的结构域定位至其BRCT结构域, 这为深入理解Pescadillo的重要作用提供了新的线索.     

乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT2结构域染色质伸展活性的定位

40 %～ 5 0 %的遗传性乳腺癌和至少 80 %的既有乳腺癌又有卵巢癌家族史的患者是由BRCA1突变引起的 .BRCA1C末端含有 2个BRCT结构域 (BRCT1和BRCT2 ) ,它们与BRCA1的重要功能密切相关 .许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中 .利用染色质结构检测技术表明 ,BRCT结构域具有染色质伸展活性 .利用缺失突变技术构建了 6种BRCT2结构域 (175 6～ 185 2位氨基酸残基 )缺失突变体并将BRCT2结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到 175 6～ 180 8之间的氨基酸残基 ;用丙氨酸扫描技术构建了 6种BRCT2结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到 1784～ 1788之间的VQLCG .BRCT2结构域的定位有助于预测BRCT2结构域突变后发生乳腺癌的风险 ,也为进一步研究BRCT2结构域的功能机制提供了有用的材料 .     

乳腺癌易感蛋白BRCA1的BRCT1结构域染色质伸展活性的定位

乳腺癌易感基因BRCA1（Breast cancer susceptibility gene 1）在乳腺癌的发生、发展中起重要作用。BRCA1 C末端含有2个BRCT结构域（BRCT1和BRCT2）,许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1的BRCT结构域中。利用染色质结构检测技术表明,BRCT结构域具有染色质伸展活性。本文利用缺失突变技术构建了6种BRCT1结构域（1642-1736 aa）缺失突变体并将BRCT1结构域中与染色质伸展相关的重要区域定位到1691-1721之间的氨基酸残基;用丙氨酸扫描技术构建了10种BRCT1结构域丙氨酸扫描突变体并将重要氨基酸残基序列定位到1707-1711之间的IAGGK。利用定位的重要区域进行Blast分析,结果找到一新型同源蛋白质。BRCT1结构域的定位有助于预测BRCT1结构域突变后发生乳腺癌的风险,也为进一步研究BRCT1结构域的功能机制提供了有用的材料。     

利用染色质结构检测技术研究乳腺癌易感蛋白BRCA1转录激活区突变

乳腺癌易感基因BRCA1突变引起的遗传性乳腺癌中40％－50％,其突变引起的遗传性乳腺癌和卵巢癌的比例至少为80％,许多乳腺癌易感突变发生在BRCA1 C末端转录激活结构域（1560－1863aa),但该区域大部分突变导致何种表型（良性多态性或乳腺癌易感突变）目前还不清楚,由于染色质结构调节是基因转录调节的早期事件,该文基于lac阻遏物识别和结合lac操纵基因的原理,利用染色质结构检测技术比较BRCAI转录激活结构域不同突变体与野生型的染色质伸展活性,将1种野生型,2种良性多态型（S1613G和M16521）和4种乳腺癌易感突变型（A1708E,M1775R,W1837R和Y1853term)转录激活区片段以正确相位融合于lac阻遏物的下游,得到野生型重组质粒pwt和pS1613G,pM1652I,pA1708,pM1775R,pW1837R及pY1853tem6种突变型重组质粒,Western blot检测表明,这些重组质粒分别转染A03－1细胞后均表达了相应的融合蛋白。对这些重组质粒的染色质伸展活性检测表明：野生型pwt和两种良性多态性突变体不具有染色质伸展活性或只有极微弱的染色质伸展活性,而其他4种乳腺癌易感突变体均具有过强的染色质伸展活性,提示利用染色质伸展技术可预测BRCA1转录激活区基因型与乳腺癌发生风险的表现型的关系。     

BRCA1相互作用蛋白的分离及鉴定

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene-1,BRCAl)在DNA损伤修复、细胞周期调控、染色质的稳定、基因转录激活以及细胞凋亡等方面起着重要作用。BRCAI C-末端是富含酸性氨基酸的转录激活结构域(AD),AD核心结构为两个串联的BRCT结构域(BRCTl和BRCT2)。应用酵母双杂交技术,以BRCT2为诱饵蛋白,从卵巢文库中筛选到了与BRCT2结构域相互作用蛋白FHL2(four and half LIM domains)。利用酵母交配的方法证明FHL2与BRCAlBRCT2特异结合,而不与BRCAl BRCTl、Rapl BRCT结构域结合。GST沉淀实验表明,FHL2在体外特异地与BRCT2结构域相结合;免疫共沉淀实验表明,FHL2在体内特异地与BRCT2结构域结合;FHL2可与全长BRCAl结合。BRCAl与FHL2相互作用的发现为研究BRCAl以及FHL2在肿瘤发生、发展中的作用打下了坚实的基础。     

白氏文昌鱼FADD的克隆及功能研究

Fas死亡结构域相关蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)是死亡信号转导通路中的连接蛋白,在脊椎动物中其结构和功能都很保守.本文首次克隆了头索动物白氏文昌鱼(Branchiostoma belched)FADD(bbFADD)的cDNA和基因组DNA序列.bbFADD cDNA全长1239 bp,编码217个氨基酸.与脊椎动物的FADD一样,bbFADD含有N端的死亡效应结构域(Death Effector Domain,DED)和C端的死亡结构域(Death Domain,DD).bbFADD氨基酸序列的第33位氨基酸苯丙氨酸在进化过程中相对保守,此苯丙氨酸在FADD自我相互作用中具有重要作用.哺乳类的FADD基因编码区含有两个外显子,而bbFADD基因含有3个外显子.一般认为头索动物处在无脊椎动物进化到脊椎动物的中间过渡阶段,但基于FADD氨基酸序列的系统进化树和同源性分析显示,文昌鱼与海胆的亲缘关系更近.bbFADD在HeLa细胞中超表达能够引起HeLa细胞的凋亡,暗示bbFADD可能能够在人类细胞凋亡通路中起作用,推测凋亡系统在生物进化过程中相当保守.     

Pescadillo抗体的制备及其表达研究

为深入研究Pescadillo的生物学功能及其在肿瘤发生过程中的潜在作用, 将该分子与GST融合表达, 融合蛋白经纯化、洗脱、免疫小鼠后获得其多克隆抗体, 运用抗体检测了Pescadillo分子的表达, 发现该分子的表达受雌激素的诱导; 该分子主要分布于乳腺、卵巢、小肠等细胞分裂旺盛的组织; 此外, 在人肾癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌以及不同的乳腺癌细胞株中均发现Pescadillo的表达; 通过比较乳腺癌患者癌组织与癌旁组织中Pescadillo的表达水平发现, 它在癌组织中的表达水平显著增加. 以上结果表明, Pescadillo可能在肿瘤的发生、发展中具有重要作用, 是肿瘤诊断与治疗的潜在靶标     

辐射诱导基因LRIGx的细胞周期特异性表达及编码产物同源性分析

低剂量辐射诱导表达新基因LRIGx被克隆 .Northern印迹杂交结果表明 ,在 0 2Gyγ射线照射后 2～ 4h ,人A5 4 9细胞中该基因mRNA表达水平显著上调 .当照射剂量增加到 2Gy时 ,其诱导表达水平明显低于 0 2Gy照射 .通过细胞周期同步化 ,观察到LRIGx基因表达高峰在G2 M期 .同源性比较和功能保守域分析结果显示 ,该基因编码产物与DNA修复和重组蛋白RAD5 4、ERCC 6 ,染色质重构和转录调节功能蛋白SWI2 SNF2等有同源性 ,其N端具有与染色质重构、基因转录调控和DNA修复有关的 3个功能结构域 ,即CHROMO、SNF2N和解旋酶C端结构域     

鲫Nub1基因的克隆及特征分析

Nub1(NEDD8 Ultimate Buster-1)是近年来发现的一种干扰素诱导表达基因,过量表达该基因能抑制细胞生长。研究通过RACE-PCR方法从产生干扰素的鲫囊胚培养细胞(Carassius auratus blastulae embryonic cells,CAB)中克隆出鲫Nub1基因。鲫Nub1全长cDNA为2298bp,编码一个由589个氨基酸残基组成的蛋白。推导的鲫NUB1蛋白具有哺乳类同源蛋白保守的结构域,包括N端的UBL结构域和C端两个UBA结构域,与已知的哺乳类包括人和小鼠、鸟类和两栖类的同源蛋白具有41%-45%的相似性。诱导表达分析显示PolyI:C和LPS均能诱导CAB细胞Nub1mRNA的上调,表明Nub1基因在鱼类的抗病免疫反应中发挥某种重要作用。       

人脑内-含有ACP样结构域新基因的发现

为寻找脑内新基因,以正常成人全脑cDNA为模板,采用锚定PCR方法进行扩增,将经琼脂糖DNA电泳 鉴定获得的一约1200bp大小的特异性条带回收,并克隆入Teasy载体.用310 Genetic Analyzer进行自动测序. 所得序列进行生物信息学分析BLAST相似性分析结果证明所得序列为新序列,读框分析表明,该序列中存在 一完整编码区,编码含357个氨基酸的蛋白质.ProDom软件分析发现其含有酰基携带蛋白(ACP)样结构域. 随后,经3'RACE法克隆到该基因的全长cDNA,其全长为2024bp,染色体定位在14q11.2,含有16个外显子, 15个内含子,该基因已登录到GenBank.经设计编码区引物,从Teasy载体扩增出编码区后再克隆入pGEX-4T1 表达载体,经异丙基硫代-D-乳糖苷(IPTG)化学诱导表达.其编码区克隆人pGEX-4T1表达载体后,转入 JM109宿主菌,经IPTG诱导已得到表达.点杂交及RNA印迹表明,该基因在正常成人脑内广泛高表达.     

重组人源SNX7蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及磷脂结合特异性分析

Sorting nexins(SNXs)是一类含有SNX-PX结构域,并在细胞内吞和内体分选运输过程中发挥重要调节作用的蛋白。SNX7是SNXs家族中的一员,含有PX结构域和BAR结构域,属于SNX-PX-BAR亚家族。斑马鱼实验表明,SNX7是在肝脏中大量表达的抗凋亡蛋白,并在胚胎肝脏的发育中发挥关键作用。为了从蛋白水平对SNX7进行研究,首先将编码人源PX-BARSNX7(SNX7的一个片段,包含PX和BAR结构域)的cDNA片段插入到原核表达载体p28a中,再将重组质粒转化到大肠杆菌Rosseta 2(DE3)中诱导表达,并用亲和层析、离子交换和分子筛层析对PX-BARSNX7进行了纯化。Western blotting结果表明,亲和层析、离子交换和分子筛层析纯化后获得了高纯度的PX-BARSNX7蛋白。动态光散射实验显示PX-BARSNX7蛋白均一性良好。磷脂结合实验表明,PX-BARSNX7具有较为广泛的磷脂酰肌醇结合能力,能够与PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3结合。     

一种基于GFP分子荧光显示的检测大尺度染色质松弛技术的建立

在真核生物中,基因组DNA是被高度包装成染色质的形式而存在的,这就对基因在复制、转录、修复、重组时的功能分子有效地接近DNA形成了天然屏障,执行上述生化反应需要松散染色质的结构,染色质松散是染色质动态变化即染色质重塑(chromatin remodeling)的一种形式.越来越多的证据表明,染色质重塑在DNA损伤反应中起着非常重要的作用,染色质重塑过程可以把损伤应答和修复蛋白募集到损伤位点,从而完成修复.为了进一步探讨染色质重塑和DNA损伤修复的偶联机制,采用了基于Lac抑制子和Lac操纵子的大规模染色质重塑报告系统,并借助GFP分子荧光显示方法,建立了可以直观地观察染色质松散的技术.在利用该技术证实了DNA损伤应答蛋白TIP60能够强烈诱导染色质松散的基础上,发现P53诱导基因3蛋白(PIG3)在细胞辐射DNA损伤反应中也能够一定程度地诱导染色质松弛.这些结果证明此技术是可靠的,也为阐述DNA损伤修复与染色质重塑关联机制提供了新的信息.     

一种转录受病原物接种和机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定

WRKY基因编码一类植物特异性转录因子,该类基因目前在双子叶植物中得到了较好的研究.为了研究WRKY基因在单子叶植物中的生物学功能,从水稻(Oryza sativa L.)中分离了OsiWRKY基因的cDNA.该cDNA可编码一个含482个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质预测的一级结构中含有一个WRKY结构域,在该结构域中发现了一个典型的C2-H2锌指结构模块.OsiWRKY预测的一级结构中还可能含有一个细胞核定位因子;利用瞬时表达体系,发现OsiWRKY与GFP绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白的确定位在水稻细胞核中.在凝胶阻滞实验中,体外表达的OsiWRKY蛋白可特异地结合W-box顺式因子.在水稻白叶枯病原细菌接种实验中,OsiWRKy基因的转录本在抗病品种(IR-26)中的诱导增加强度明显高于感病品种(Jingang 30).在模拟接种的水稻中,OsiWRKy基因的转录本也表现诱导增加,但其诱导增加的起始时间和幅度要显著低于水稻白叶枯病原细菌接种的水稻植株.这些结果表明,OsiWRKY基因可能编码了一个含有WRKY结构域的转录因子,该转录因子可能参与了水稻对病原物接种和机械创伤的反应,但OsiWRKY蛋白调节两种反应的机制可能有所不同.     

人类Cornulin蛋白S100结构域钙依赖的多聚化能有效减少细胞的损伤

在哺乳动物中发现一类新的能够抵制环境压力和保持组织完整性的应激蛋白.含有S100钙结合结构域的Cornulin(CRNN)是这类蛋白质之一,它在人类食管鳞状上皮细胞中高表达,而在食管鳞状上皮细胞癌中却低表达,它能抑制脱氧胆酸诱导的细胞损伤.S100结构域在CRNN的功能上具有重要作用.为了进一步探讨CRNN S100结构域的生物学特性,克隆、表达、纯化了该结构域,证明其折叠正确,适合用于生物物理和生物化学特性的研究.更为重要的是,通过核磁共振、凝胶过滤层析、超速离心、质谱和蛋白质交联分析,发现S100结构域具有钙依赖的多聚性质,而多聚体的形成更有利于保护细胞免受脱氧胆酸和乙醇的损伤.上述结果表明,S100结构域是CRNN发挥功能的关键结构域,它可以通过多聚化更好地保护细胞.该工作将进一步揭示S100结构域的生物学功能.     

含磷酸结合口袋的BRCT结构域功能位点预测

BRCT( BRCA1 C-terminus)是真核生物DNA损伤修复系统重要的信号传导和蛋白靶向结构域.为了探讨含磷酸结合口袋的BRCT与磷酸化配体结合的机制,对XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1和TopBP1BRCT1进行了结构保守性和表面静电势分析.结果显示,4个BRCT的磷酸结合口袋周围所存在的结构保守并带正电势的沟槽很可能是其功能位点,并且类似的沟槽在含磷酸结合口袋的BRCT中普遍存在.沟槽两侧及底部均带有极性氨基酸残基,两侧带正电荷,而底部疏水.这说明沟槽与配体的结合以静电和疏水相互作用为主.沟槽主要位于单个BRCT中,而且4个BRCT的沟槽在形状和电荷分布上都不同,说确明BRCT配体特异性主要由单个BRCT决定.磷酸结合口袋位于沟槽中心,说明沟槽可能同时结合磷酸化残基的N端和C端附近残基.     

基因标记、转化、表达与检测

930450采用交叉调节系统使大肠杆菌表达I组蛋白[会,英]/Kalli0,P.…,Abstr.Pap.Am.Ch—em.Soc.一1992,203Meet,Pt.1.一BI OT‘84[译自DBA,1992,11(15),92—083573 这个新表达系统的产物礞白是氯霉素酰基转移酶。CAT基因和cI阻遏物基因的转录由tac启动子来调节,而lacI基因的转录则由九·噬菌体pL一启动子调控。加入诱导物IPTG可提高CAT蛋白和cI阻遏物的表达,从而抑制lac阻遏物的表达,进一步增强CAT的表达。叙述了在各种拷贝数的质粒中对新系统的构建,并将CAT表达的结果与通常使用的构成性调节系统散了比较。分批诱导的结果与…     

人类免疫球蛋白超家族一个新成员:α-1B糖蛋白前体基因的克隆和分析

应用RACE方法,从人肝Marathon cDNA中克隆一1694bp的cDNA,其中开放阅读框架在43～1530bp,编码495个氨基酸,1～17氨基酸为信号肽,有4个IGc2结构域,与从人血浆分离的α-1B糖蛋白高度同源,是一个尚未克隆的α-1B糖蛋白前体基因,属于免疫球蛋白超家族的一个新成员,可能在细胞识别和细胞行为的调节方面起作用.     

棉花MADS-box蛋白基因(GhMADS-13)的克隆和表达分析

一组具有MADS-box结构域的转录因子在控制花器官的诱导与发育中起着重要作,以中棉所36(CCRI)均一化全长cDNA文库为基础,结合EST测序分析,分离获得一个棉花的MADS-box基因全长cDNA.该基因cDNA全长1 079 bp,包含一个732 bp的完整的开放阅读框,编码234个氨基酸,具有典型的MADS-box结构域和完整的K区,命名为GhMADS-13(GenBank:FJ409870).与拟南芥、葡萄等植物的AGL6类基因具有高度的同源性.实时定量RT-PCR分析表明,GhMADS-13在CCR136的花器官发育中早期表达量逐步增加,后期有下降趋势.推测GhMADS-13可能在开花诱导和花器官发育过程中起着重要作用.     

LysM蛋白介导植物免疫防卫反应及其信号激发的研究进展

溶解素基序(LysM)是一类普遍存在于大多数有机体中的蛋白质结构域。植物细胞中含有LysM结构域的蛋白能够识别不同种类含有N-乙酰葡糖胺结构的配体分子,从而启动植物对病原菌的特异防御反应。作为一种重要的模式识别受体,LysM结构域蛋白通过不同形式的寡聚化、受体类胞质激酶BIK1和MAPK级联反应向下游传递信号,而病原菌能够通过其分泌的效应蛋白特异性识别或修饰模式识别受体,规避植物细胞中病原体相关分子模式诱导的免疫反应。该文主要综述受体激酶/蛋白在病原菌激发子识别和防卫反应启动中的作用。     

茶树CsCBF1基因克隆和转录活性分析

采用RACE技术克隆了一个受冷诱导的茶树CBF基因全长cDNA,命名为CsCBF1(GenBank登录号为EU563238)。CsCBF1cDNA全长序列为1 211bp,开放阅读框编码259个氨基酸。氨基酸序列分析表明,CsCBF1具有CBF家族典型的保守结构域,与其他植物的CBF具有较高的相似性;与拟南芥、辣椒和橡胶树编码的CBF相似性分别为56%、63%和56%。亚细胞定位结果表明,CsCBF1位于细胞核内。分别将10个CsCBF1缺失突变体与GAL4DNA结合域融合的结果显示,CsCBF1的羧基末端酸性结构域(第137位氨基酸至259位氨基酸)在酵母中具有转录激活活性。实时定量RT-PCR分析表明,CsCBF1基因受低温的快速诱导表达。