水稻条纹病毒RNA4基因间隔区的分子变异

应用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）和单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism,SSCP)技术快速检测我国水稻条纹病毒（RSV）RNA4基因间隔区（intergenic region,IR)的分子变异,结果表明,我国RSV RNA4 IR存在分子变异。供试的7个分离物共有4种泳动带型,其中YL、BS、JD、LY分离物完全一致,而YL、BS、YL及JD4个分离物序列完全一致;JN、PJ、SQ3个分离各不一样,序列之间的同源性均在92％－94％之间.IR序列内部具有两个重要的结构特征：（1）有两处反向重复序列,可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但中一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大;（2）具有插入序列,相对于日本M分离物,我国7个分离物都有一段长19bp的插入序列,这段插入序列比较保守,各分离物之间仅有1－2个碱基的差异。     

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区序列分析——混合侵染及基因组变异证据

克隆和测定了我国水稻条纹病毒（RSV）22个分离物 RNA4基因间隔区（Intergenic region,IR）序列,序列比较结果表明,我国RSV RNA4 IR在长度上存在634bp、654bp及732bp 3种不同的类型,其中3种不同类型的序列在云南省均有存在,而在其它省份仅存在654bp 类型的序列,云南省还存在不同片段类型序列在同一分离物中混合侵染的现象。序列内部具有两个重要的结构特征,一是具有插入序列;二是有两处反向重复序列,可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但另一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大。本论文还讨论了插入片段特性、不稳定的发夹结构的形成最低自由能及病毒致病性分化的关系。     

细菌介导的RNA干扰对C.elegans中par-3基因的作用

设计并构建了针对par-3基因的发夹RNA载体，将构建好的质粒转入大肠杆菌HT115，25℃喂食Caenorhabditis elegans（C.elegans）野生型虫体，24h后观察par-3（RNA干扰）celegans的胚胎发育情况。结果显示通过喂食形成发夹结构dsRNA的细菌可以对celegans中par-3基因进行RNA干扰，干扰率可以达到60％以上。干扰后的早期胚胎发育丧失第一次卵裂的不对称性，第二次卵裂的纺锤体方向发生改变，与par-3突变体的观察结果一致，为进一步在mex-3转基因虫体中通过RNA干扰研究基因表达打下了基础。     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过RT-PCR扩增了我国水稻条纹病毒(RSV)山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物RNA4基因间隔区(intergenic region,IR)序列,并克隆于pGEM-T easy载体上.序列分析结果表明:JN、YL两分离物RNA4 IR均由654个核苷酸组成,两者之间的同源率为92%.JN、YL两个分离物RNA4 IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大.这些结果说明了我国水稻条纹病毒存在明显的分子变异.     

microRNAs功能研究进展

microRNAs(miRNAs)是一类长约20～24个核苷酸的单链非编码小RNA分子,由一段具有发夹结构的70～80个核苷酸长度的单链RNA前体(pri-mRNAs)在类RNaseⅢ酶Dicer的剪切下而生成.miRNAs在各种生物中广泛存在,具有保守性,与机体生长发育、分化、疾病有着密切的联系.主要对MiRNAs最新的功能研究进展进行了综述.     

RNA聚合酶Ⅱ启动子调控RNA 干扰在肿瘤治疗中的应用前景

RNA干扰是双链RNA介导的特异性转录后基因表达沉默现象.由于双链小干扰RNA介导的RNA干扰技术设计简便、作用迅速、效果明显,目前已被广泛应用于基因功能和重大疾病治疗的研究,尤其为肿瘤治疗提供了一条新途径.利用RNA干扰技术通过调节肿瘤发生发展相关基因的表达可制定出一系列有效的抗癌策略.然而在现行大多数策略中往往采用不可调控的RNA聚合酶Ⅲ启动子(H1,U6)表达经典的发夹结构RNA,经由Dicer酶切割成功能性siRNA,因此缺乏组织细胞靶向性和抗癌效率.最新研究表明,采用RNA聚合酶Ⅱ启动子可弥补由RNA聚合酶Ⅲ启动子调控RNA干扰缺陷和不足.此外,运用病毒载体特别是具有靶向和溶瘤效应的肿瘤特异性复制腺病毒,介导RNA聚合酶Ⅱ启动子调控表达siRNA有望成为更有效的治疗手段.     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

单核苷酸多态性SNP（rs34040607）与中国人胃癌相关性的研究

目的：探讨胃癌组织中17号染色体q25-3区单核甘酸多态性位点rs34040607与人胃癌的相关性。并初步探索其可能的生物学机制和效应。方法：应用Taqman探针实时定量PCR分型法,检测50例胃癌患者及对照非胃癌患者基因组中此位点的多态性。应用RT．PCR法,检测胃癌组织中此位点转录产物及转录方向。应用最小自由能方法预测此位点突变对非编码RNA发夹结构形成的影响。结果：中国人胃癌患者中此位点多态性存在高变异。与正常对照人群存在显著差异。该位点存在转录活性,且转录方向为单向,由着丝粒向端粒方向转录。该点突变导致转录的非编码RNA发夹结构改变。结论：SNP位点rs34040607变异可以作为胃癌易感性预测的靶点,在未来的基因筛查中可作为一个重要候选位点,对该位点的转录及对RNA发夹结构的改变揭示了其发挥功能的一个可能的机制。     

RNase MRP RNA and human genetic diseases

RNase MRP RNA is the RNA subunit of the RNase mitochondrial RNA processing （MRP） enzyme complex that is involved in multiple cellular RNA processing events. Mutations on RNase MRP RNA gene （RMRP） cause a recessively inherited developmental disorder, cartilage-hair hypoplasia （CHH）. The relationship of the genotype （RMRP mutation）, RNA processing deficiency of the RNase MRP complex, and the phenotype of CHH and other skeletal dysplasias is yet to be explored.     

细菌介导的发夹结构双链RNA对秀丽小杆线虫中par-1基因的RNA干扰

秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)是一种重要的模式生物,目前在C.elegans中发现的许多基因在序列和功能上与哺乳动物的基因有很高的同源性,对其基因功能的研究有助于阐明哺乳动物的基因功能。为检测细菌介导的通过发夹结构表达双链RNA(dsRNA)的RNA干扰(RNAi)在C.elegans中的作用效果,我们设计并构建了可以转录表达母源极性基因par-1的发夹dsRNA的RNAi载体,并转入E.coli HT115中,经过IPTG诱导后浓缩。浓缩菌液在25℃下喂食C.elegans48h后,观察C.elegans胚胎发育情况,同时以含有空载体的菌液作为对照,并与par-1突变体及野生型比较。结果显示:发夹结构表达的dsRNA对par-1基因进行RNAi后,虫体内par-1 mRNA几乎消失,C.elegans早期胚胎分裂不对称性丧失,par-1(RNAi)干扰率在95%以上。     

解析MicroRNA参与疾病的机理

<正>MicroRNAs(miRNAs)是普遍存在的、调控基因表达的短非编码(≈22nt)小分子调节RNAs,是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。1993年,miRNAs在秀丽隐杆线虫     

番茄丛矮病毒p19蛋白抑制转录后基因沉默作用机制

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是真核生物体内由双链RNA（double—stranded RNA）介导的同源RNA降解现象。在细胞内,长的dsRNA被Dicer酶切割成21～26核苷酸（nucleotide,nt）的小干扰RNA（small interfering RNA或short interfering RNA,siRNA）;siRNA与多种蛋白结合后形成RNA诱导沉默复合物（RNA—induced silencing complex,RISC）,同时解链;有活性的RISC可在siRNA的指引下与互补的转录物结合,并导致RNA的降解,     

针对SARS冠状病毒S蛋白的RNAi设计

为研究SARS冠状病毒的RNA干涉,以S蛋白为目标选取16个RNA干涉的靶序列,并设计用于体内转录形成以U6为启动子的siRNA发夹结构的DNA,拟将设计的DNA瞬时转染靶细胞,用定量RT-PCR法确定目标RNA被干涉的程度,用Western blot在蛋白质水平上进行监测。针对SARS冠状病毒的RNAi设计为进一步研究奠定了理论基础,其工作的开展将在RNAi治疗、SARS冠状病毒基因功能研究、新药开发等方面发挥重要作用。     

长链内含子非编码RNA在基因表达过程中的调控作用

在绝大多数人类基因中都存有非蛋白编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）.长链内含子ncRNA（long intronic non-coding RNA,lincRNA）是众多ncRNA中的一员,而内含子区域则是具有调节性的ncRNA的关键源.长链内含子ncRNA可通过作为短链RNA的前体、或是与启动子元件的交互作用、组蛋白甲基化修饰、蛋白编码RNA选择性剪接以及蛋白质编码RNA的稳定性,从而对基因表达进行调控.至此我们可以逐步揭示出基于长链内含子ncRNA的调控系统模式.     

植物RNA沉默的分子机制研究进展

RNA沉默（RNA silencing）是真核生物中的一种抵抗外源遗传因子（病毒、转座子或转基因）及调控基凶表达的防御机制。参与植物RNA沉默的酶及蛋白质主要包括6种RNA依赖的RNA聚合酶、4种Dicer-like（DCL）核酸内切酶和10种Argonautes蛋白。植物中4条RNA沉默途径分别由微小RNA（miRNAs）和3种小干扰RNA（siRNAs）介导,包括反式作用siRNAs（ta－siRNAs）、天然反义siRNAs（natsiRNAs）和异染色质siRNAs（hc-siRNAs）。在植物RNA沉默的系统性传播中,由DCL4或DCL2将dsRNAs裁剪为次级SiRNAS,以放大RNA沉默信号和增强沉默效应。     

蛋白质中较频繁发生的β发夹结构（β—Hairpins）模式──蛋白质超二级结构（MOTIF）研究（Ⅲ）

分析了２４０个分辨率在２．５Ａ以上的高精度蛋白结构,研究了α螺旋和β折叠的连接短肽中的β发夹结构模式。首先对较频繁发生的超二级结构组中的Ｅ—ｌｏｏｐ—Ｅ［１］（即β回折结构－βＴｕｒｎ）进行了分析,对每一种β回折结构的氢键长度进行了计算,然后将其模型化。在对β发夹模型化的分析中,同时考虑了连接短肽的长度和氢键模式两个因素。找出了在２４０个蛋白样本库中较常发生的β发夹结构的模式。该结果对结构比较模型、Ｘ衍射晶体结构的解析,以及β发夹结构的预测有一定意义。     

细菌RNA稳定性调控相关元件的研究进展

RNA降解体（细菌RNA降解的主要执行者）是一种多亚基的蛋白质复合物,主要由RNA解螺旋酶、聚核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase,PNPase）、内切核酸酶（ribonuclease E,RNase E）以及糖酵解途径中的烯醇化酶、磷酸果糖激酶等组成,参与核糖体RNA（ribosome RNA,rRNA）的加工以及信使RNA（messenger RNA,mRNA）的降解。此外,RNA分子伴侣Hfq和调控小RNA（small RNA,sRNA）在RNA稳定性调控中也发挥着重要作用。综述了细菌RNA稳定性调控相关功能元件,特别是降解体蛋白及RNA分子伴侣Hfq的最新进展,以期为研究细菌RNA稳定性及其参与的代谢调控提供理论参考。     

哺乳动物中作用于非编码RNA的RNA编辑研究进展

RNA编辑是RNA转录过程中序列变化而引起的一种基因动态调控机制。腺苷脱氨酶（adenosine deaminases acting on RNA, ADAR）参与RNA编辑,将双链RNA中腺苷残基（A）转化为肌苷（I）,接着被转录和拼接成鸟苷（G）。由ADAR催化,作用于RNA的A-I型RNA编辑是人类最常见的转录后修饰。近年来,这种修饰不仅存在于编码RNA中,在非编码RNA（noncoding RNA, ncRNA）中也逐渐被发现,如microRNA（miRNA）、小分子干扰RNA（siRNA）、转运RNA（tRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。这种修饰可能通过对microRNA和mRNA之间结合位点创造或破坏,进而影响ncRNA的生物起源、稳定性和靶向识别功能。目前,对这种生物现象的机制及ADAR底物,尤其是在ncRNA中的特性仍然没有得到充分的认识。主要对哺乳动物中ncRNA上的RNA编辑进行总结,并列举一些阐明其生物学功能的计算方法。     

脂肪组织RNA提取方法的改进

本试验以猪脂肪组织为材料,应用TRIzol、V-gene、H.Q＆.Q三种总RNA提取试剂盒分别提取脂肪组织RNA,发现直接按照试剂盒说明书操作提取的RNA效果不理想.通过反复试验,分别改进了提取过程中的部分操作步骤,结果表明：三种试剂盒操作方法改进后与改进前相比,提取RNA的纯度和得率表现为差异极显著（P＜0.01）;三种试剂盒操作方法改进后提取RNA的纯度差异不显著（P＞0.05）,但在得率方面,Trizol比其它两种高,表现为差异极显著（P＜0.01）.三种试剂盒操作方法改进后提取的RNA经RT-PCR扩增猪β-actin基因,电泳结果显示,扩增条带清晰、特异,说明提取的RNA完全符合后续的分子生物学实验要求.     

从矿化的骨组织中提取骨细胞的总RNA

描述了两个从以含大量羟基磷灰石（钙）和细胞密度、数量甚低为特点的矿化的成年骨组织（成年大鼠颅骨）提取总RNA的改进方法.紫外分光光度法（A260、A280和A230）和1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳予以鉴定.进而以其逆转录的cDNA为模板扩增出β-actin和BMP-2基因,均表明所得总RNA完整和模板活性俱佳.总RNA产量平均为560μg/g骨组织.