转化的大鼠胚胎成纤维细胞系差异表达基因的筛选研究

来源于转化的大鼠胚胎成纤维细胞系的两株细胞,A1－5细胞与B4细胞相比表现出非常强的抗辐射性并伴随不同寻常强的G2延迟效应;用PCR选择性抑制消减杂交方法对这两株细胞进行差减,希望找到对A1－5细胞表现出的不同寻常的表型起关键作用的某一个或某一些基因。结果得到了160个差减转化子,逐个进行序列测定,并进行Dot blot杂交,共得到35个差异表达基因片段（EST）。通过对美国国家生物技术信息中心（NCBI）的非冗余序列库（NT）、鼠EST库及人EST库的BLAST进行同源检索,发现其中21个代表了尚未登录的新基因,另外14个分别与已知基因高度同源。     

火炬松热胁迫cDNA文库的表达谱分析

以火炬松热胁迫cDNA文库的EST序列为材料,对EST序列进行聚类、拼接等处理后,再进行Blast同源比对以及基因GO注释分析。研究结果如下:从Forest TreeDB数据库中下载了火炬松热胁迫cDNA文库的所有EST序列,共4 283条。EST序列经CAP3拼接后,获得2 062个UniGene,其中934个Contig,1 128个Singletons。对UniGene进行同源检索,按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分三个不同分类角度分类,被赋予功能的基因数累计达4 661个,但365个(17.7%)的序列与核酸和蛋白数据库无序列同源性,即17.7%为新发现的基因。经对所有具有功能的基因研究发现,受外界胁迫表达的抗逆相关基因含量较高。上述研究结果对于研究火炬松热胁迫基因表达特征与抗逆分子机制具有一定的借鉴价值,以及开发火炬松新分子标记与开展分子辅助育种具有一定的指导意义。     

EST分析技术在鸡基因组学研究中的应用

表达序列标签（EST）是由大量随机取出的cDNA库克隆经测序得到的组织或细胞基因组的一段cDNA序列,一个EST代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因。综述了EST分析技术在鸡基因组研究中的应用。如用于鉴定、发现和预测鸡的新基因,用于基因图谱的绘制,用于筛选基因的单核苷酸多态性（SNP）位点,用于基因表达分析和基因芯片制作等。EST数据库和生物信息学的联合分析技术在推动家鸡后基因组的研究中发挥着重要的作用。     

高山植物黄管秦艽cDNA文库构建与表达序列标签（EST）分析

黄管秦艽（Gentiana officinalis）是一种重要的藏药高山植物,本研究构建了该物种开花期的eDNA文库。经检测达到中等cDNA文库水平,文库滴度为1．2×10^7pfu／ml,重组率95．9％,插入片段平均长度大于500bp。对343个随机挑选的重组克隆进行部分测序,获得的ESTs经编辑后共有181条有效序列。经生物信息学方法分析181条表达序列标签（EST）代表144个单克隆序列,其中55个与已鉴定的基因同源,35个序列与未鉴定的EST匹配,54个未找到同源序列;后两者共有89个EST序列未发现功能相似的蛋白。对已鉴定的EST进行功能分析发现,相关基因主要编码以下蛋白：与蛋白表达相关的占35％;光合作用相关的占笠％;新陈代谢相关的占18％;抗性相关的占11％;质膜运输和细胞分裂相关的分别占5％;染色体变化和细胞信号转导的分别占2％。根据有效EST序列设计引物,通过RT-PCR进一验证了所得EST的准确性。这些研究结果为将来研究黄管秦艽的功能基因以及该物种与相关物种的群体遗传学、进化生物学等方面提供了基础。     

中国地方品种香猪的肌肉特异组织表达序列标签（ESTs）的分析

通过构建香猪肌肉组织cDNA文库,并在文库中随机挑选克隆进行测序的方法,获得了131个香猪肌肉EST序列。在这131个EST序列所代表的109个单一克隆中,有99个为人类及其他物种的同源序列,3个为已知的猪的ESTs,7个为未知ESTs。对这10个已知、未知ESTs进行开放阅读框预测并进行BlastX分析,没有找到高度同源的氨基酸序列。对上述EST所对应的基因功能分析结果表明,除去27．27％的EST未能分类外,克隆到的EST大多来自与基因／蛋白的表达调控相关的基因（占45．46％）。来自具有其他功能的基因的EST依次是细胞代谢占10．10％、细胞结构／迁移占10．10％、细胞／机体防御占5．05％和细胞信号／传导占2．02％。没有发现和细胞分裂相关的已知功能基因。本研究结果为中国地方品种香猪提供了第一个骨骼肌的基因表达谱,为今后寻找猪肌肉生长和肉用品质的候选基因奠定了基础。     

应用抑制性消减杂交分析全反式维甲酸和1,25-二羟维生素D_3诱导结肠癌细胞的相关基因

 为探讨结肠癌细胞诱导分化的机制 ,采用抑制性消减杂交 (suppression subtractivehybridization,SSH)研究联合使用全反式维甲酸和 1 ,2 5-二羟维生素 D3诱导分化结肠癌 Lo Vo细胞前、后差异表达的基因 .经比较消减 c DNA文库的序列与基因库的序列 ,发现 :有 1个基因的序列与正常鳞状上皮细胞中的 1个表达序列标签 (expressed sequence tag,EST)高度同源 ,同时发现6个新 EST (基因库登录号为 AW2 66492、AW2 66493、AW2 66494、AW58751 8、AW58751 9和AW58752 0 ) .说明诱导分化涉及到多个基因的表达 ,结肠癌的发生是多基因综合作用的结果 .进一步研究这些基因和 EST的功能对于结肠癌的防治将有重要意义 .     

成人视网膜假定蛋白基因ARHP的克隆及生物信息学分析

从UniGene库中选取编号为BG2 2 2 62 4来自人鼻咽组织的表达序列标签 (EST )序列 ,联网到NCBI调用Blast服务器分析 ,发现该EST序列是一个代表新基因的未知序列 .利用Blast检索GenBank的nr数据库和EST数据库 ,构建EST重叠群 ,联网到NCBI的ORFfinder服务器 ,分析发现该EST重叠群具有完整的阅读框架 .分别在cDNA序列阅读框架的起始密码子和终止密码子的两侧设计引物 ,以人胎脑cDNA文库为模板 ,进行PCR扩增 ,测序确定该基因的cDNA全长序列 .该基因cDNA序列全长为 1672bp ,阅读框架位于第 3 0 4～ 1557位之间 ,编码由 417个氨基酸组成 ,分子质量为 46 58ku的蛋白质 ,其理论 pI为 4 2 1.将蛋白质序列通过NCBI的Blast服务器进行序列相似性分析 ,发现该基因编码的蛋白质和成年小鼠视网膜未知蛋白 (BAB3 2 2 14 )同源 .经与国际人类基因组命名委员会协商定名为成人视网膜假定蛋白 (adultretinahypotheticalprotein ,ARHP) ,GenBank登录号为AY174896.生物信息学分析表明 ,该蛋白质可能为一参与转录调控的核蛋白 .ARHP基因定位在染色体 5q3 5,跨越 3 5163bp ,含 4个外显子和 3个内含子 .在基因的 5′非翻译区有 2个CpG岛     

cDNA(EST)文库的高通量生物信息学分析体系的构建与应用

应用生物信息学方法,构建了一套针对cDNA或EST文库的高通量、自动化分析体系,CLASP(cDNA Library Analysis SystemPrimary)。CLASP基于Linux操作系统,主要由Perl程序构成。它以cDNA文库(ESTs)序列为分析对象,具有自动查找序列同源基因并进行染色体定位(包括细胞遗传学定位和SIS定位)、EST自动延伸等功能;并对不同来源序列进行聚类分析。应用该体系对3对肺癌相关抑制性消减杂交(SSH)cDNA文库进行了分析。结果在所有3对文库的2083条EST中有1492条找到了同源基因,其中1365条得到染色体定位。对所余591条未知基因的EST进行了电子延伸,其中有214条EST得到不同程度的延伸。对上述cDNA文库中已知基因的EST以及电子延伸后的EST再分别进行聚类分析,而后综合两个聚类分析的结果,由此可发现不同文库间的共同与差异表达基因,可用于特定性状相关的基因功能预测。     

胃癌相关cDNA片段的快速克隆和表达分析

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌和正常组织有差异表达的表达序列标签(EST)-W123(GenBank登录号为AF150631),通过与GenBank的dbest库进行电子杂交,选取了与其同源度高的若干EST,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物,利用cDNA末端快速扩增PCR（RACE）技术得到了7条带有polyA尾的3′EST,进行序列分析后,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST,且具有共同的保守序列,已登录GenBank.采用RNA印迹对目的序列进行初步鉴定,并进行了这些基因的组织分布分析.RACE技术和生物信息学相结合,具有快速、高效的特点,有助于疾病相关基因的克隆.     

Gene expression profiling in porcine fetal thymus

To obtain an initial overview of gene diversity and expression pattern in porcine thymus, 11,712 ESTs (Expressed Sequence Tags) from 100-day-old porcine thymus (FTY) were sequenced and 7,071 cleaned ESTs were used for gene expression analysis. Clustered by the PHRAP program, 959 contigs and 3,074 singlets were obtained. Blast search showed that 806 contigs and 1,669 singlets (totally 5,442 ESTs) had homologues in GenBank and 1,629 ESTs were novel. According to the Gene Ontology classification, 36.99% ESTs were cataloged into the gene expression group, indicating that although the functional gene (18.78% in defense group) of thymus is expressed in a certain degree, the 100-day-old porcine thymus still exists in a developmental stage. Comparative analysis showed that the gene expression pattern of the 100-day-old porcine thymus is similar to that of the human infant thymus.     

Identification of preferentially expressed mRNAs in retina and cochlea

To search for genes that could be involved in genetic disorders primarily involving the retina and the cochlea, we tried to identify mRNAs preferentially expressed in retina and cochlea and to establish their chromosomal localization. Two approaches were employed. First, a mouse subtracted library (retina + cochlea against liver + brain) was generated. Randomly selected cDNA clones were sequenced and compared to databases. Tissue expression of some of them was analyzed by RT-PCR. Using radiation hybrid cell lines, the mouse chromosomal localization was determined for those showing the highest level in the retina and the cochlea. Second, human Expressed Sequence Tags (ESTs) with preferential expression in the retina and the cochlea were searched for in databases, and chromosomal localization was also established. From 171 sequenced clones, 73 were classified as known genes (with 17 clones coding for 6 genes), 86 were homologous to ESTs, and 12 were unidentified. Of 108 selected clones, 22 (18.5%) had the highest level of expression in the retina and/or the cochlea, while expression was higher in another tissue or ubiquitous for 60 (55.5%) and 22 (20.4%) of them, respectively. By RT-PCR, one clone similar to the mouse Asic3 cDNA (proton-gated channel) was found mainly in the retina and cochlea, but its human ortholog was widely expressed. We selected 17 ESTs from the UniGene database with restricted expression including in the retina and cochlea. We mapped 10 of these ESTs as well as four mouse clones from the subtracted library. Some of them localized to morbid intervals. The combined information from expression analysis and chromosomal localization allowed for the identification of potential candidate genes for retinal diseases (CORD8, CORD9) and syndromic blindness/deafness/renal defects.     

应用大规模测序技术和生物信息学研究造血干/祖细胞的基因表达及新基因的识别和克隆

从新生儿脐血和成人骨髓中分选出造血干／祖细胞（ＨＳＣ／ＨＰＣ）,构建成ｃＤＮＡ文库,对其进行大规模表达序列标签（ＥＳＴ）测序,通过生物信息学等手段分析基因表达谱,并进行新基因的全长ｃＤＮＡ克隆。在所测的１０５１２条可分析ＥＳＴ序列中,有９８６６条来自脐血ＣＤ３４＋细胞,其中４６９７条（４７６％）为已知基因,２６０３条（２６４％）为已知ＥＳＴ,１４１５条（１４３％）代表未知ＥＳＴ。在已知基因中,８２％基因与造血相关,２２７％涉及细胞代谢、结构和迁移,１３０％与细胞分裂和防御相关,２６２％与ＲＮＡ、蛋白质的合成相关,１０６％和细胞信号传递有关。对一些已知和未知的ＥＳＴ,综合测序、生物信息学等方法,进行全长克隆,已获得２３个新基因的全长ｃＤＮＡ。     

Gene expression profile of human bone marrow stromal cells: high-throughput expressed sequence tag sequencing analysis

Human bone marrow stromal cells (HBMSC) are pluripotent cells with the potential to differentiate into osteoblasts, chondrocytes, myelosupportive stroma, and marrow adipocytes. We used high-throughput DNA sequencing analysis to generate 4258 single-pass sequencing reactions (known as expressed sequence tags, or ESTs) obtained from the 5' (97) and 3' (4161) ends of human cDNA clones from a HBMSC cDNA library. Our goal was to obtain tag sequences from the maximum number of possible genes and to deposit them in the publicly accessible database for ESTs (dbEST of the National Center for Biotechnology Information). Comparisons of our EST sequencing data with nonredundant human mRNA and protein databases showed that the ESTs represent 1860 gene clusters. The EST sequencing data analysis showed 60 novel genes found only in this cDNA library after BLAST analysis against 3.0 million ESTs in NCBI's dbEST database. The BLAST search also showed the identified ESTs that have close homology to known genes, which suggests that these may be newly recognized members of known gene families. The gene expression profile of this cell type is revealed by analyzing both the frequency with which a message is encountered and the functional categorization of expressed sequences. Comparing an EST sequence with the human genomic sequence database enables assignment of an EST to a specific chromosomal region (a process called digital gene localization) and often enables immediate partial determination of intron/exon boundaries within the genomic structure. It is expected that high-throughput EST sequencing and data mining analysis will greatly promote our understanding of gene expression in these cells and of growth and development of the skeleton.     

用DDRT-PCR方法克隆小鼠精子发生早期相关基因的EST

为了避免差异显示技术中的放射性污染 ,并用之于筛选、克隆精子发生早期的相关基因 ,分离纯化了小鼠的原始精原细胞及B型精原细胞 ,提取其总RNA ,逆转录获得cDNA ,以荧光差异显示方法筛选差异表达基因。利用斑点杂交技术对差异片段进行快速鉴定以排除假阳性。选取 16条差异显著的片段做克隆测序 ,通过Gen Bank/Blast比较 ,有 7个片段属于新的EST ,且均表现为在B型精原细胞中表达强度高于原始精原细胞。提交Gen Bank获得注册号。从中选取较有意义的 3条基因片段通过半定量RT PCR方法进一步验证其表达特征。和传统的差异显示方法比较 ,文中所采用的mRNA差异显示技术可快速排除假阳性结果 ,避免同位素标记带来的放射性污染。结果表明所获得的 7个新EST均表现为B型精原细胞中高表达 ,这些表达升高的基因可能与其后精子发生过程中的一系列特殊现象 (如减数分裂、变态成形 )有关 ,为生精细胞的分化做物质上的准备。     

人参植物与皂苷生物合成相关的差减cDNA文库构建及基因差异表达分析

应用抑制差减杂交技术,分别以源于4年和1年生人参根组织cDNA群体作为检测子(tester)与驱赶子(driver),成功构建了与人参植物皂苷生物合成相关的差减cDNA文库,并时从中筛选的阳性cDNA克隆进行DNA测序及其序列分析、PCR及Northern印迹杂交鉴定．结果显示,获得的13个克隆为新基因序列．其中6个差减克隆系人参植物根生长发育阶段差异表达基因．目前,6个差异表达新基因的结构与功能仍在进一步研究中．     

病毒感染草鱼胸腺的EST分析和免疫相关基因的鉴定

以感染草鱼(Ctenopharyngodon idellus)出血病病毒(GCHV)的草鱼胸腺为材料,构建了草鱼胸腺的SMARTcDNA文库.筛选文库获得到1933条有效EST序列.BLASTX分析显示,583条序列在公共数据库中能找到同源基因(E-value≤1.00E 10-3,Identities≥30%),另外1350条序列则找不到显著同源性.已知基因按具体功能可划分为6类,大部分与细胞内的各种生理过程、细胞结构以及免疫防御相关.研究结果从分子水平上表明鱼类的胸腺在机体感染病毒的免疫反应中发挥重要作用,同时也表明胸腺组织在病毒感染后可能表达很多目前还不清楚功能的新基因.