地高辛探针检测重组肝靶向干扰素宿主DNA残留量的研究

目的:建立检测重组肝靶向干扰素宿主DNA残留量的方法,根据此法检测3批重组肝靶向干扰素每人份剂量宿主DNA残留量。方法:以重组肝靶向干扰素工程菌基因组DNA为模板,并制备探针,用此标记探针对3批重组产品进行DNA残留量检测。结果:3批次重组肝靶向干扰素原液每人份剂量宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:地高辛标记探针斑点杂交检测DNA残留量具有特异性强,灵敏度高,重现性好,操作简单,能快速高效检定重组肝靶向干扰素原液并对其制备过程进行质量监控。     

地高辛标记探针检测重组人干扰素β_(1b)中DNA残留量

为检测注射用重组人干扰素β1b半成品中外源性DNA残留量,以重组人干扰素β1b工程菌基因组DNA为模板,用地高辛标记探针,并以此探针进行点杂交。结果证明,该方法检测灵敏度较好,特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素β1b制备过程中的质量监控及半成品的检定。     

人β干扰素N端序列的变异与其抗病毒活性的关系

研究了人β干扰素N端序列的变异与其抗病毒活性的关系。采用DNA重组技术获得了两种干扰素变种:一种N端序列为MWIRGF,另一种为MAIRGF。这两种干扰素变种的抗病毒活性都明显下降。此结果提示,人β干扰素的N端序列对抗病毒活性起主导作用,在改造该蛋白结构时,应避免改动N端结构。     

Beta~((β))干扰素开始临床试验

对大规模生产和临床试验干扰素(重组DNA方法制造的)的巨大兴趣已集中在alpha,(α)干扰素并在一定程度上集中在gamma(Υ)干扰素上。目前,重组beta (fibroblaα)干扰素,即抗病毒和癌的干扰素的临床试验,将在与Shell oil公司达成协议之后,用Cetus公司的产品开始进行     

应用P_RP_L串联启动子和CIts857调控基因高效表达人γ干扰素

应用DNA重组技术,将去信号肽的人γ干扰素(HuIFN_γ)cDNA插到质粒p HE 6的P_RP_L启动子下游。该质粒含有CIts857抑制子基因。转化大肠杆菌DH5a后,通过升温诱导法,即将培养温度从30℃升到42℃,人γ干扰素cDNA可获得高效表达。分子量约为17.5kd,滴度可达2.4×10~3单位/升菌液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的扫描表明,γ干扰素的表达量约占细菌可溶性蛋白总量的30％。对细菌生长与干扰素表达的关系做了动力学研究。本文对重组人γ干扰素的发酵生产提供了技术基础。     

链霉菌DNA克隆系统研究进展

自从1974年细菌DNA的体外重组技术问世以来,以大肠杆菌为材料所做的DNA克隆的努力,已经取得了很大的成就。人的生长激素、胰岛素、干扰素等已经可望利用微生物来生产。DNA体外重组技术在生产实践上的应用,必将对人类带来深远的影响。以DNA重组技术为基础的遗传工程能不能应用于放线菌?由于放线菌这一类微生物所产生重要的次级代谢产物如抗生素等,对医药、     

重组人干扰素α2a软膏的动物皮肤试验

目的 :观察动物皮肤接触重组人干扰素α2a软膏后所产生的刺激反应情况 ,动物完整皮肤及破损皮肤短期内接触重组人干扰素α2a软膏所产生的急性毒性反应以及通过动物皮肤重复接触重组人干扰素α2a软膏后 ,观察机体免疫系统反应在皮肤上表现。方法 :选择家兔和豚鼠为试验动物 ,将干扰素软膏涂在脱毛的动物皮肤上 ,以赋形剂为空白对照 ,2 .4—二硝基氯代苯为阳性致敏物对照。结果 :本品对皮肤的刺激强度〈0 .5 ,即重组人干扰素α2a软膏无刺激性和弱致敏性。结论 :重组人干扰素α2a软膏动物试验中未见皮肤刺激性和过敏性发生 ,说明本品具有较高的安全性     

重组人干扰素α2b阴道泡腾片的研制

目的:制备重组人干扰素α2b阴道泡腾片,并对其质量和局部用药安全性进行研究。方法:将重组人干扰素α2b经制粒干燥,用酸、碱分开制粒法制备重组人干扰素α2b阴道泡腾片,按照《中国药典》对其性状、重量差异、崩解时限、pH、干扰素效价、水份含量、稳定性以及局部刺激性进行了考察。结果:本品处方、工艺合理,制备过程对干扰素生物活性影响较小;制剂质量符合规定,在4℃低温条件下保存具有较好的稳定性;局部刺激试验对家兔阴道组织无明显的刺激性。结论:该制剂质量稳定、可控,具有良好的稳定性和安全性。     

定向进化人α型干扰素基因家族的研究

应用DNA改组(DNAshuffling)技术重组了12种人α型干扰素基因,并结合噬菌体表面呈现(phagedisplay)技术构建了噬菌体干扰素改组文库,采用简便的、功能性的定向竞争筛选方法,获得了比活达1 0×109IU/mg的新型α型基因工程复合干扰素,是目前国际上已投产的α2型干扰素的5倍,具有生产应用前景,上述策略也为其它细胞因子或酶的改造提供了借鉴方法。     

人αD型干扰素cDNA 3′端非编码序列对该基因在大肠杆菌中表达的影响

本文采用DNA体外重组技术,研究了人αD型干扰素cDNA 3′端非编码序列对该基因在大肠杆菌中表达的影响。发现3′端非编码序列的缺失,使得人αD型干扰素基因在大肠杆菌中的表达水平降低约87倍。这一结果提示,在进行人αD型干扰素cDNA在大肠杆菌中的表达设计时,有必要保留其3′端非编码序列。     

HPLC法测定重组人干扰素α1b粉雾剂的含量

采用高效液相色谱法测定重组人干扰素α1b粉雾剂的含量及均匀度。结果表明溶液中重组人干扰素α1b浓度在92.50~462.50μg/ml时峰面积（Y）与相应浓度（X）呈线性关系,（r=0.999 9）。并且在成品的含量测定时,重组人干扰素α1b的色谱峰峰形良好,杂质与流动相无干扰。本方法精密度、准确度高,稳定性良好,能够准确、迅速的测定重组人干扰素α1b粉雾剂成品中的主药含量及均匀度。     

重组DNA技术(续)

四、DNA的体外重组 DNA重组技术,当用于干扰素、胰岛素、疫苗、免疫球蛋白等物质的生产时,目前多半采用从mRNA反转录成cDNA,然后和载体DNA重组,再转化至大肠杆菌内进行复制和表达。在某一基因结构已清楚的情况下,亦可人工合成该基因(如人胰岛素基因等),再将该基因嵌入载体引进大肠杆菌中。若从基因库中分离出的基因,由于已含有内含子(Intron),     

关于我国药典重组DNA技术产品总论的思考

自1982年全球第一个生物技术药物“基因重组人胰岛素”、1989年中国批准第一个生物技术药物“重组人干扰素α1b”上市以来,生物技术药物已成为制药业中发展最快、活力最强和技术含量最高的领域。药品的规范生产与质量控制与其安全有效性密切相关,欧美药典中均设有对此类药品质量控制的总体要求。《中国药典》2010版三部已收录包括12类共计34个品种的重组DNA技术产品各论,在进一步保障药品安全、提高质量控制水平的编制指导思想下,《中国药典》2015版拟纳入对重组DNA技术产品的总体要求,本文就相关起草工作从产品涉及范畴、制造与产品检定等方面进行阐述。     

重组人干扰素和细菌内毒素对家兔致热阈剂量的影响

确定重组人干扰素和细菌内毒素对家兔致热阈剂量的影响。按照《生物制品热原质试验》要求 ,测定纯细菌内毒素对家兔致热阈剂量、重组人干扰素中细菌内毒素对家兔致热阈剂量以及干扰素的药物热阈值。纯细菌内毒素对家兔致热阈剂量为 5EU/mL ,重组人干扰素中细菌内毒素对家兔致热阈剂量为 1 .2 5EU/mL ,重组人干扰素的药物热阈值为 1 5EU/剂量。重组人干扰素和细菌内毒素对家兔的致热性存在协同作用。     

生物工程技术预测

一、医药与医疗方面利用重组DNA技术商品化生产胰岛素(84.2～87.1)、干扰素(84.6～87.7)、牛生长激素(84.12～88.2)、人生长激素(85.8～89.2)、肝炎疫苗(85.9～89.1)和癌疫苗(93.10～97.6)。利用重组DNA技术开发感冒疫苗(85.G～89.1)和癌疫苗的生产技术(89.7～93.1)。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在毕赤酵母中的融合表达及其活性研究

为了获得结核分枝杆菌ESAT 6蛋白在毕赤氏酵母中的高效表达 ,将人α-2a干扰素基因、结核分枝杆菌esat-6基因经PCR扩增并加上相应的酶切位点 ,两基因之间的DNA接头编码肠激酶识别的多肽 ,DNA经酶切连接插入分泌型载体pPIC9K ,将重组表达质粒pPIC9K-α2a-esat6用SalⅠ单酶切之后 ,电击转入PichiapastorisSMD1168中 ,采用G418梯度筛选获得高抗性转化子。以甲醇作为诱导物 ,发酵4d后取上清 ,进行SDS PAGE和Westernblot鉴定并分析表达产物的干扰素活性。结果表明 ,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小约为 30kD的融合蛋白 ,表达产物不仅具有较高的干扰素活性 ,而且可以和结核病人血清发生特异性结合 ,为结核病的特异性诊断和结核病新型疫苗的研制打下了基础.     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

将重组人干扰素α2b栓剂在不同温度下保存不同时间,检验干扰素生物活性、溶出度试验、融变时限、pH值和微生物限度及外观的稳定性。重组人干扰素α2b栓剂在4~8℃条件下放置48个月;在20~25℃条件下放置24个月IFN生物活性未见下降,37℃放置4个月IFN生物活性未见下降。重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质有较好的稳定性。     

重组马g-干扰素抗病毒活性测定及单克隆抗体抑制活性鉴定

为了测定大肠杆菌和杆状病毒表达的重组马g-干扰素是否具有抗病毒活性, 利用这两种干扰素处理马胎肾细胞(EFK-78), 然后接种表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组水泡性口炎病毒(VSV*GFP), 观察干扰素对病毒表达GFP的抑制, 测出其抗病毒活性单位分别为1×103 AU/mL、1×105 AU/mL。评价了制备的九株抗重组马g-干扰素单克隆抗体是否可抑制重组马g-干扰素抗病毒活性, 证实其中一株可中和重组马g-干扰素的抗病毒活性。结果表明: 杆状病毒表达的马g-干扰素具有较高的抗病毒活性, 其活性可被一株制备的抗重组马g-干扰素单克隆抗体抑制; 首次获得原核表达的具有抗病毒活性的马g-干扰素。     

糖蛋白和基因工程

近年来重组DNA技术不仅在蛋白质结构与功能的研究中已成为有用的新方法,而且已发展为工程性的应用学科—基因工程。因其具有广泛的应用前景,而倍受重视,是生物工程中最引人注目的一个领域。很多蛋白质和肽类物质已经可用基因工程方法进行生产。很多“生物工程公司”也就芸芸而生。重组DNA的表达产物已经或准备作为生物制品或药物走向市场,用于多种疾病的治疗,诸如:人胰岛素、人生长激素、干扰素、组织纤溶酶激活剂(TPA)、红血球生成素(EPO)和乙型肝炎疫苗。     

重组人干扰素α2b栓剂稳定性研究

研究重组人干扰素α2b栓剂的稳定性。方法将重组人干扰素α2b栓在不同温度下保存不同时间,分别检验干扰素生物学活性、溶出度试验、融变时限、pH和微生物限度及外观的稳定性。结果重组人干扰素α2b栓在4~8℃条件下放置当时和放置48个月后的IFN生物学活性基本一致,未见下降;在20~25℃条件下放置24个月后IFN生物学活性未见下降,放置32个月后活性下降32%,36个月后IFN生物学活性下降55%;37℃条件下放置4个月后IFN生物学活性未见下降。结论重组人干扰素α2b栓剂的生物学活性及理化性质的稳定性好。