团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5′端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)促性腺激素Iβ(GtH Iβ)亚基基因5′端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示:克隆得到的GtHIβ亚基基因5′端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptx1等可能对GtH Iβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtH Iβ亚基基因5′端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。       

团头鲂促性腺激素β亚基cDNA的克隆和序列分析

本研究利用RT-PCR和RACE克隆了团头鲂（Megalobrama amblycephala）脑下垂体中两种促性腺激素β亚基（GtHIβ和GtHIIβ）cDNA序列,并对其进行了结构和系统进化分析。团头鲂GtHIβ亚基cDNA全长567碱基对（bp）,5’端非翻译区26bp;3’端非翻译区148bp;开放阅读框（ORF）393bp,其编码含有130个氨基酸的蛋白质,包括由108个氨基酸组成的成熟肽以及22个氨基酸组成的信号肽。GtHII亚基cDNA全长564bp,5’端非翻译区43bp;3’端非翻译区95bp;ORF426bp,其编码含有141个氨基酸的蛋白质,包括由117个氨基酸组成的成熟肽以及24个氨基酸组成的信号肽。团头鲂GtHIβ亚基氨基酸序列与青鱼（Mylopharyngodon piceus）等15种鱼类相比较,相似性为90%—31%,与湖蛙（RanaRidibunda）等5种四足类的相似性为38%—21%;GtHII亚基与青鱼等15种鱼类相比较,其相似性为95%—41%,与湖蛙等5种四足类的相似性为49%—36%,团头鲂GtHIβ和GtHII亚基与鲤科鱼类的相似性最高,显示出较为亲近的进化关系。另外,团头鲂GtHIβ和GtHIIβ亚基含有12个保守的半胱氨酸残基和1个N糖基化位点。     

草鱼促性腺激素受体的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术从草鱼性腺中克隆出两种促性腺激素受体基因(FSHR和LHR),采用N-J法构建了系统进化树。通过RT-PCR及Real-time PCR技术对FSHR和LHR在成体草鱼不同组织中的时空表达进行分析,发现FSHR和LHR在草鱼卵巢、精巢中表达明显,表达量随着卵母细胞的发育逐渐增高,以上结果为进一步探讨GTHR在鱼类生殖周期中的生理功能奠定了基础。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素前体蛋白的克隆与表达

促性腺激素释放激素（gonadotropin—relying hormone,GnRH）是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对性腺发育的作用,构建了GnRH cDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT—PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL—c2x中构建重组表达质粒pMAL—GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41．6％。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose—sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经Factor Xa酶切裂解,Amylose—sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。该研究为鱼类GnRH蛋白的控制性腺成熟和抗体制备打下了基础．是国内鱼类GnRH前体蛋白在原核细胞中成功表扶的首次报道．     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

抚仙金线鲃促性腺激素亚基基因克隆及组织表达分析

抚仙金线鲃Sinocyclocheilus tingi是云南抚仙湖特有种,虽然实现了人工繁殖,但在塘养环境下仍无法自然繁衍。鱼类的生殖活动受下丘脑-垂体-性腺轴的调控,其中促性腺激素在该过程中起重要作用。本实验利用实时荧光定量PCR和c DNA末端快速扩增技术从抚仙金线鲃垂体中克隆了GTHα、FSHβ和LHβ3种基因的c DNA序列,其中GTHα的开放阅读框(ORF)长度为357 bp,编码118个氨基酸,有10个半胱氨酸残基和2个N-糖基化位点;FSHβc DNA全长为856 bp,ORF长度为393 bp,编码130个氨基酸,有11个半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点;LHβc DNA全长为930 bp,ORF长度为441 bp,编码146个氨基酸,有12个半胱氨酸残基和1个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR结果显示,GTHα和LHβ都只在雄鱼和雌鱼的垂体中表达。FSHβ在垂体中表达量最高,在雌鱼和雄鱼的脂肪、肌肉和雄鱼的精巢和肝脏中有少量表达。本研究为抚仙金线鲃的人工繁育提供了重要的基础数据。     

史氏鲟两种促性腺激素β亚基cDNA克隆及序列进化分析

从史氏鲟(Acipenserschrenkii)脑垂体中提取总RNA,利用GeneRacerTM技术,分别克隆得到促性腺激素Ⅰ(GTHⅠ)和Ⅱ(GTHⅡ)的β亚基cDNA全长。史氏鲟GTHⅠ-β亚基cDNA全长为1088bp,开放阅读框为384bp,编码128个氨基酸(Genbank序列登录号为:AY575920);GTHⅡ-β亚基cDNA全长为616bp,开放阅读框为408bp,编码136个氨基酸(Genbank序列登录号为:AY575921)。与其他脊椎动物进行了两种基因的氨基酸序列同源性比较表明:史氏鲟GTHⅠ-β与西伯利亚鲟相似性最高,为99·1%;与硬骨鱼类中鲈形目相似性最低,为34·5%。GTHⅡ-β与西伯利亚鲟相似性为98·3%,与其他硬骨鱼类除鲈形目外都超过60%,与鸟类的相似性最低,为42·8%。两个基因成熟肽构建的MP树显示:GTHⅠ与FSH的β亚基和GTHⅡ与LH的β亚基构成两个明显的聚类。用Mega2软件计算了所比对物种间开放读码框的核苷酸遗传距离并构建了NJ树和MP树,两个基因β亚基的NJ系统树和MP系统树拓扑结构相似,鲟鱼与真骨鱼类分别聚类,共同形成硬骨鱼纲聚类,与传统分类学一致。成熟肽相似性、遗传距离和系统树分支长度显示GTHⅠ-β亚基在真骨鱼类进化速率显著快于其他脊椎动物,而LH-β亚基在羊膜动物中进化比其他脊椎动物快。暗示这两种糖蛋白基因的进化伴随物种进化而显示其功能[动物学报52(2):362-375,2006]。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3 (AP3)在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育.研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子.因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用.本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥(Arabido-psis thaliana) AP3基因启动子序列(U30729)设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plus DNA聚合酶扩增了长度为1 767 bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其GenBank登录号为FJ619533.Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18 (AL132971) 9 264～11 030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白(CAB81799),说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子.PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等.本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3::GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础.     

岩原鲤促性腺激素基因的克隆和组织表达差异

通过RT-PCR技术从岩原鲤(Procypris rabaudi)卵巢组织中克隆了促性腺激素GtHα、FSHβ、LHβ3个亚基的mRNA序列。GtHα亚基开放阅读框长357 bp,编码118个氨基酸残基,第1～23个氨基酸为信号肽。FSHβ亚基开放阅读框长393 bp,编码130个氨基酸残基,第1～22个氨基酸为信号肽。LHβ亚基开放阅读框长444 bp,编码147个氨基酸残基,第1～28个氨基酸为信号肽。氨基酸序列比对结果表明,GtHα亚基在近缘物种间比较保守,其氨基酸序列的相似性要高于FSHβ和LHβ亚基。通过Real-time fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)分析发现,GtHα亚基在检测的6种组织中均有表达,卵巢中的表达量极高,肝、脑、心、垂体和肌肉中表达量依次降低;FSHβ亚基在除肌肉外的其余5种组织中均有表达,卵巢中的表达量最高,脑和心中表达量次之,肝和垂体的表达量明显偏低;LHβ亚基只在卵巢和垂体中表达,卵巢中的表达量要明显高于垂体。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP(SEPALLATA)类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、Box I和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE-motif以及胁迫响应元件HSE、TC-richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用。为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRHcDNA的原核表达载体并进行融合表达。利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%。菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的目的蛋白。目的蛋白经FactorXa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白。以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P<0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答。     

团头鲂黏蛋白基因Muc5b克隆及表达分析

摘要：黏液（mucus）在鱼体防御外界病原侵袭、信息传递、调节渗透压等方面具有重要作用。黏蛋白（mucin）作为黏液的基础骨架组分,与其相关的研究正受到广泛的关注。在本研究中,作者克隆获得团头鲂（Megalobrama amblycephala）Muc5b mRNA 的部分序列3895 bp,并通过qRT-PCR分析了Muc5b在团头鲂不同组织的表达分布及其在捕捞应激后在鳃和表皮中的表达变化。序列分析结果显示,团头鲂Muc5b与鲤等脊椎动物的Muc5b有较高的同源性,其N端含有黏液蛋白特异性结构域：三个VWD区域,三个C8区域,二个TIL区。组织表达分析结果表明,Muc5b在鳃和表皮表达量相对较高,在脑、脾、肾中表达水平较低,在肝、肠道几乎不表达。捕捞应激后1 h时鳃中Muc5b显著降低（P < 0.05）,24 h时恢复初始水平;表皮中4 h时Muc5b显著上升（P < 0.05）,24 h时恢复到初始水平。     

人整合素β3亚基真核表达载体的构建及表达

构建人整合素β3亚基全读码框(ORF)基因真核表达载体,为探讨整合素β3作为汉坦病毒(Hantavirus,HV)受体的特异性奠定基础.根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从原核质粒中扩增出人整合素分子β3亚基ORF基因,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,采用酶切和PCR鉴定,选取初筛正向插入的阳性克隆进行测序,序列分析表明与公布的人整合素β3亚基ORF核苷酸序列基本一致,并通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达,经间接免疫荧光法检测证实pcDNA3.1-β3能在宿主细胞中高效表达.     

水稻 Rubisco 小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻(Oryza sativa)中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

玉米逆境诱导型启动子克隆及其植物表达载体构建

设计特异引物,利用PCR方法从玉米(Zea mays)基因组DNA中克隆低温和盐相应蛋白(low temperature andsalt responsive protein,LS)基因上游1 735 bp,命名为Lsp。利用在线启动子预测工具PlantCARE分析表明,序列中含有TATA-box和CAAT-box等核心元件,还包含各种胁迫响应元件。以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将克隆得到的启动子片段与GUS报告基因融合构建了重组表达载体pCAM-Lsp,并用反复冻融法将其导入农杆菌EHA105,通过农杆菌介导法转化烟草,GUS组织化学染色显示出Lsp驱动GUS基因表达。结果表明,该Lsp启动子片段具备一定的启动活性,为探明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制的研究奠定基础。     

拟南芥AtNHX5基因的cDNA克隆及其正义、反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从拟南芥品种Landsberg的实生苗叶片中克隆AtNHX5基因的cDNA,核酸序列表明该基因编码区为1 554 bp,编码538个氨基酸.与GenBank发表的序列(AF490589)相比,有三处碱基不同,分别为850 bp处的G(GenBank的为A)、904 bp处的T(A)、985处的G(A).将该基因分别正向或反向置于CaMV35S启动子之后,可构建正义、反义表达载体.     

含PR启动子的原核高效表达载体的构建及应用

组建了一个仅含PR启动子的原核高效表达载体pRC,它同时含有cⅠ调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列.现已成功地用于表达重组人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)、重组人白细胞介素-3(hIL-3)和抗溶菌酶(HEL)抗体Fd基因,表达量均占菌体总蛋白的36%以上.同时还研究了不同的宿主菌和原核增强子序列等因素对PR启动子载体表达的影响.此外,还比较了分别以PR、PL或PRPL作为启动子时表达hTNF-α的情况,结果表明,单用PR或PL启动子可获得与使用PRPL串联启动子一样的高效表达.     

人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达

目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素（TPO）的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5’端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和PlA3 3种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT〉pB3．9T〉pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5’端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。     

苦瓜中与AGAMOUS相似基因启动子的克隆和表达载体的构建

McAG2基因是苦瓜中分离得到的与AGAMOUS相似基因,在花器官和果实中特异表达,参与花的第三轮和第四轮器官的形成.文章采用染色体DNA步移技术克隆得到长为1 417 bp的McAG2基因5'上游片段.序列分析显示此片段含有典型的TATA-box、CAAT-box、丰富的激素应答调控元件.为了研究这些调控元件,还构建了McAG2基因5'侧翼缺失和内含子缺失表达载体.     

长双歧杆菌分泌型表达载体的构建及Tum-5基因的表达

摘要：目的 构建能在双歧杆菌内稳定存在并高效分泌表达外源基因的长双歧杆菌质粒表达载体。方法 以质粒pBAD/glll为基础,以双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的分泌性信号肽取代质粒原有的分泌性信号肽,并将双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因克隆入载体中,构建表达载体pBBADs。将人Tum-5基因克隆入载体中,构建质粒pBBADs-Tum-5,电转化长双歧杆菌NCC2705,L-阿拉伯糖诱导表达后,Western Blot鉴定基因表达。结果 成功的构建了长双歧杆菌分泌型质粒表达载体,Tum-5基因在双歧杆菌内可以表达。结论 构建的表达载体为双歧杆菌用于肿瘤靶向基因治疗奠定了基础。