基于第二代测序技术兰州鲇线粒体基因组全序列测定与分析

研究采用高通量第二代测序技术,构建获得兰州鲇（Silurus lanzhouensis）线粒体基因组全序列,并对全序列特征和结构进行了分析。研究结果表明,兰州鲇线粒体基因组全序列长度为16523 bp,碱基组成具有高A+T低G+C含量的偏向性,具有脊椎动物典型的结构组成。13个PCG基因中存在2种启动子（ATG、GTG）、3种终止子（TAG、TAA和T或TA）。除tRNA-Ser（AGN）基因二级结构中DHU臂缺失,其余21个tRNA基因可折叠成典型三叶草结构。12S rRNA二级结构由45个茎环结构组成4个结构域,16S rRNA由54个茎环结构组成6个结构域。含有关键序列标签的控制区（CR）可分为3个不同的结构域:终止序列区（TAS1、TAS2）、中央保守区（CSB-F、CSB-E和CSB-D）和保守序列区（CSB1、CSB2和CSB3）。非编码区含有一段保守的控制轻链复制起始的序列区（O_L）。基于线粒体基因组全序列和通用标签COX1基因标记可区分兰州鲇同其他鲇形目鱼类种质进化关系。     

南方鲇肝脏线粒体DNA的简便分离纯化方法

摸索出可消除南方鲇肝脏ｍｔＤＮＡ制备中出现的白色干扰物的方法,采用该方法处理后的ｍｔＤＮＡ可用于限制性分析。     

银环蛇线粒体基因组全序列分析

根据GenBank公布的蛇类物种线粒体基因序列和已知的引物序列,总共设计和合成了9对引物.采用保真度较高的Ex-Taq酶,以总基因组DNA为模板进行PCR扩增,产物纯化后进行TA克隆和步移测序,拼接后获得了全长17 144 bp银环蛇线粒体基因组全序列.其共编码13种蛋白质、2种rRNA和22种tRNA.这些基因没有内含子,基因间排列紧密,仅有极少或完全没有核苷酸,甚至相互重叠.除了含有2个调控线粒体基因组复制和转录的控制区外,其余基因在长度和位置等方面与其它脊椎动物均具有较高的同源性.     

温度及光照驯化对南方鲇线粒体代谢补偿调节的影响

为了检验在季节驯化中温度和光周期分别对南方鲇（Silurus meridionalis Chen）组织线粒体代谢补偿效应的调节作用,研究对实验鱼进行了4个系列的驯化处理:（1）低温等光周期12.5℃,12L:12D,体重:（186.362.77） g;（2）高温等光周期27.5℃,12L:12D,体重:（202.807.99） g;（3）短光照中等温8L:16D,20℃,体重:（284.8013.47） g;（4）长光照中等温度16L:8D,20℃,体重:（283.7015.60） g,每组均为24尾鱼。驯化8周后取样,测定了各驯化组鱼体心脏、肝脏和肾脏的器官质量（器官指数）,以及这3种器官组织线粒体在测定温度为12.5℃、20℃和27.5℃时的呼吸率和细胞色素C氧化酶（CCO）活性。结果显示,在等光周期条件下,低温驯化组（12.5℃,12L:12D）实验鱼的心脏、肝脏和肾脏的器官指数均显著高于高温驯化组（27.5℃,12L:12D）;在中等温度条件下不同光照处理的实验鱼之间器官指数无显著差异。在中等温度条件下短光照驯化组（8L:16D,20℃）鱼体的心脏、肾脏和肝脏组织线粒体呼吸率和CCO活性均显著高于长光照组（16L:8D,20℃）;而在等光周期条件下的不同温度驯化并没引起这3种组织线粒体的呼吸率和CCO活性的明显差异。综合认为:在季节驯化过程中,光周期改变是引起线粒体代谢能力的主要因素,温度变化则是调整器官组织重量的主要因素,光周期与温度对南方鲇线粒体代谢机制的调整具有协同作用。       

南方鲇不同组织间线粒体代谢的比较研究

采用人工繁殖的同批南方鲇(Silurus meridionalis Chen)幼鱼为研究对象,分别在7.5、10、12.5、17.5、22.5、27.5、32.5、35和37.5℃条件下测定其心脏、肾脏、肝脏、脑和白肌的线粒体呼吸率、细胞色素c氧化酶(CCO)的活性,以检测不同组织线粒体的含量及代谢特征的差异性。在27.5℃下,南方鲇心脏、肾脏、肝脏、脑和白肌线粒体状态3呼吸率分别为69.94、30.98、32.36、18.89和7.34 nmol O2/min.mg;CCO活性分别为676.54、327.46、294.34、153.23和65.73 nmol O2/min.mg。统计检验表明,状态3呼吸率和CCO活性均表现为:心脏显著高于其他4种组织(P<0.05),白肌则要显著低于其他4种组织(P<0.05),肾脏和肝脏之间差异不显著,但均显著高于脑(P<0.05)。试验测定了以上5种组织的柠檬酸合酶(CS)活性来表征组织中线粒体含量。在27.5℃条件下CS的活性则分别是17.93、7.20、8.42、6.12和1.35 U/mg,心脏显著高于其他4种组织(P<0.05),肝脏、肾脏和脑之间差异不显著,但都显著高于白肌(P<0.05)。在7.5℃—32.5℃范围内,南方鲇的心脏、肝脏、肾脏、脑和白肌5种组织的线粒体状态3呼吸率和CCO活性均随着温度的升高而增加,但在高温端,心脏中这两种代谢指标开始出现随温度上升而下降的趋势。在低温端(7.5℃—10℃)和高温端(35℃—37.5℃),各组织线粒体呼吸率RCR值多数小于4,在37.5℃下的心脏和7.5℃下的白肌的RCR值分别低至1.76和1.85。研究结果提示,南方鲇不同组织间线粒体含量可以由CS活性作为间接指标进行比较,而各组织间线粒体含量及其代谢能力存在较大的差异。心脏表现出高含量、高代谢能力和低的耐受高温能力;白肌为低含量、低代谢能力和低的耐受低温能力;肝脏、肾脏和脑表现为中等含量、中等活性和较高的耐受极端温度能力。     

赤麂线粒体全基因组的序列和结构

提取赤麂细胞株总DNA,参照我们实验室已测定的同属动物小麂线粒体全基因组序列设计引物,PCR扩增、测序、拼接,获得赤麂线粒体全基因组序列并进行生物信息学分析。赤麂线粒体全基因组序列全长16354bp。定位了22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白编码基因和1个D-loop区。赤麂与小麂及其它哺乳动物线粒体的基因组结构相同,它们的序列同源性都较高。     

南方大口鲇消化道细菌群落结构与其胃肠分化的关系

以肉食性南方大口鲇(Silurus soldatovi meridonalis Chen)为对象, 研究采用PCR-DGGE指纹技术对其仔稚鱼胃肠道分化过程及细菌群落结构进行了对比分析, 进而探讨了细菌群落与胃肠道分化的关系。消化道外部形态和胃肠切片显示13日龄样品起, 胃肠在结构上出现较大的分化。DGGE分析结果显示胃肠道细菌群落的分化始于18日龄:从18日龄样品起, 肠内细菌群落明显开始分化, 但在随后的1833日龄期间细菌群落结构相对稳定, 而胃内细菌群落则一直处于动态变化中。这说明, 南方大口鲇仔稚鱼的个体发育过程中, 随着胃肠在组织结构上的分化, 其消化道细菌群落结构也出现了明显分化, 并且胃和肠内细菌群落结构的分化在时间上存在差异。该研究结果将为深入研究胃和肠内细菌群落的功能差异提供基础资料。       

南方鲇对饲料碳水化合物的代谢适应

已有研究表明,肉食性鱼类对饲料碳水化合物(CHO)利用较差[1,2,摄食过高水平CHO饲料后,鱼体血糖持续偏高[3,4],造成代谢负荷(Metabolism burden)加重[4],导致鱼体的生长率和饲料效率降低 [5,6],损害肝脏功能[7],影响鱼体的免疫力[8].另一些研究则发现,在大西洋鲑(Salmo salar)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等肉食性鱼类的饲料中添加一定水平的CHO可以提高生长率、饲料效率和蛋白质效率[9,10],提示这些肉食性鱼类可能在一定程度上适应CHO营养条件.     

短尾蝮蛇线粒体基因组全序列分析

参照近缘物种的线粒体基因序列设计并筛选得到8对引物,结合TA克隆和步移测序获得了全长17227bp的短尾蝮蛇线粒体基因组全序列.与多数蛇类线粒体基因组类似,其共编码包括13个蛋白、2个rRNA和22个tRNA在内的37个基因,另外还包含2个非编码的富含AT的控制区.基因间排列紧凑,多数基因间间隔极短甚至发生重叠.除nad1、cox1和nad3外,多数蛋白编码基因均以ATG作为起始密码子,终止密码子的使用则存在TAA、AGA、AGG和不完全的T4种情况.基于合并的19个tRNA基因序列组合数据采用NJ、MP和ME3种算法对21种蛇进行了初步的系统发育分析,结果表明,各主要分类单元之间的亲缘关系与前人基于形态学、线粒体12SrRNA和cytb基因序列研究的结论完全一致,这证实了基于合并的线粒体tRNA基因序列进行蛇类物种DNA分子系统学研究的可行性.     

兰州鲇线粒体Cytb基因的克隆与序列分析

为克隆兰州鲇（Silurus lanzhouensis）线粒体Cytb基因全序列,根据欧洲鲇（Silurus glanis）线粒体基因全序列设计特异引物进行兰州鲇线粒体Cytb基因的PCR扩增,得到1138 bp兰州鲇线粒体Cytb基因序列。对兰州鲇和其他13种鱼的线粒体Cytb基因核苷酸和氨基酸序列之间进行同源性比较,结果显示具有较高的同源性,核苷酸同源性介于61.38%-91.12%,氨基酸同源性介于76.62%-95.52%。对兰州鲇、欧洲鲇、大口鲇（Silurus meridionalis）、鲇（Silurus asotus）、越南鲇（Silurus cochinchinensis）的Cytb基因之间进行碱基替代分析,结果显示兰州鲇Cytb基因与鲇之间替换率最低,值为8.87%,转换/颠换值为3.21;与越南鲇之间替换率最高,值为14.41%,转换/颠换值为1.83。对本文克隆的兰州鲇Cytb基因与王庆容等测定的兰州鲇线粒体Cytb序列进行序列差异分析,结果显示两者之间替换率为11.16%,存在127个变异位点,转换/颠换比为4.08,遗传距离为0.1230。由NJ法基于兰州鲇和其他13种鱼的Cytb基因序列构建的系统进化树,结果显示与传统的分类地位基本吻合。       

猫蛱蝶线粒体基因组全序列分析

采用PCR步移法对猫蛱蝶Timelaea maculata线粒体基因组全序列进行了测定和分析.分析结果表明:猫蛱蝶线粒体基因组全长15 178 bp,包括13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一段长度为382 bp的A+T富含区,基因排列顺序与其它已知鳞翅目昆虫相同.猫蛱蝶线粒体基因组中存在很高的A+T含量(81.1％).13个蛋白编码基因中除CO Ⅰ以CGA作为起始密码外,其余蛋白质基因均以ATN作为起始密码子.COⅡ和ND4基因使用了不完全终止密码子T,其余基因均以典型的TAA、TAG为终止密码子.在所测得的22个tRNA基因中,除tRNAser(AGN)缺少DHU臂外,其余tRNA均能形成典型的三叶草结构.与其它多数鳞翅目昆虫一样,猫蛱蝶的A+T富含区中有一段由“ATAGAA”引导的保守的多聚T结构,长度为19 bp,并散在着一些长短不一的串联重复单元.     

缅甸蟒线粒体基因组全序列测定与分析

采用LA-PCR(long and accurate PCR)、巢式PCR及TA克隆测序技术,首次获得缅甸蟒Python bivittatus线粒体基因组全序列(GenBank登录号NC_021479)。分析结果表明:缅甸蟒线粒体全长17 617 bp,与其它多数蛇类线粒体基因组结构相似,由13个蛋白编码区、2个rRNA、22个tRNA和双控区组成,基因间排列紧凑;与蟒属其它物种相比,缅甸蟒线粒体在氨基酸数目上存在增减现象;tRNA中tRNA-Cys长度最短,只有57 bp,二氢尿嘧啶环无配对的茎区;缅甸蟒在两个控制区各存在3个相同的串联重复,可能是造成个体间相差87~89 bp的原因。     

大紫蛱蝶线粒体基因组全序列分析

通过PCR步移法对大紫蛱蝶Sasakia charonda coreana线粒体基因组全序列进行了测定和分析。分析结果表明:大紫蛱蝶线粒体基因组全长15233bp,包括13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因以及长度为381bp的非编码区。A、T、C、G碱基含量分别为39.7%、40.2%、12.2%、7.9%。9个蛋白编码基因和14个tRNA基因在J链编码,其余4个蛋白编码基因和8个tRNA基因在N链编码,基因排列顺序与其它已知鳞翅目昆虫相同。13个蛋白编码基因中除COⅠ以CGA作为起始密码外,其余蛋白质基因均以ATN作为起始密码子,终止密码子多数为典型的TAA、TAG,只有COⅡ和ND4以单独的T作为终止密码子。在所测得的22个tRNA基因中,除tRNA Ser(AGN)缺少DHU臂外,其余tRNA均能形成典型的三叶草结构。与其它多数鳞翅目昆虫一样,大紫蛱蝶的非编码区序列中散在着一些长短不一的串联重复单元,在与其近缘物种非编码区的比较当中并未发现共同的保守序列区。     

鳙的线粒体基因组核苷酸全序列分析

对采集自我国长江的鳙的线粒体DNA全序列进行了测定.结果表明,鳙的线粒体DNA全长为166221 bp,其碱基因组成为A=31.6%;C=27.1%;G=16.0%;T=25.3%,A+T含量为56.9%.鳙线粒体基因组的排列、结构和组成与其它鲤科鱼类相似,包括37个基因,即13个蛋白质编码基因,2个rRNA基因,22个tRNA基因和一个非编码控制区(D-loop).在13个蛋白编码基因中,除ND6由轻链编码外,其余12个基因均由重链编码.COI基因的起始密码子为GTG,而其它12个蛋白编码基因的起始密码子均为ATG.     

眼镜王蛇线粒体基因组全序列分析

参照近缘物种线粒体基因序列共设计和合成了8对引物, 结合Ex Taq-PCR、TA克隆和步移测序技术, 文章首次获得眼镜王蛇线粒体基因组全序列(GenBank登录号: EU_921899)。该基因组全长17 267 bp, 共编码13个蛋白、2个rRNA、23个tRNA-- 其中tRNA-Ile基因发生了复制, 属于一种新的蛇类物种线粒体基因排列模式, 另外还含有2个非编码的富含AT的控制区。除了8个tRNA基因和1个蛋白基因由L链编码外, 其余均由H链编码, 其中H链编码基因的A和T含量接近, 而L链上A的含量则明显高于T。基于21种蛇合并的“12S＋16S”rRNA基因序列的系统发育分析表明, 眼镜王蛇属与眼镜蛇属亲缘关系较近, 两者与环蛇属共同构成一个单系群。作为国内外眼镜王蛇线粒体基因组全序列的首次报道, 上述结果对于蛇类物种分子系统发育和进化研究具有重要意义。     

白纹佛蝗线粒体全基因组序列

通过长PCR扩增线粒体全基因组进行保守引物步移法结合克隆测序技术,对白纹佛蝗mtDNA 全序列进行了测定和分析.结果表明:白纹佛蝗线粒体基因组全长15 657 bp,包含13 个蛋白编码基因、22个tRNA 基因和2 个rRNA 基因以及1个非编码的控制区域,它们的长度分别是11 202 bp,1 486 bp,2 156 bp 和 728 bp.37个基因的位置与飞蝗的一致,有9对基因间存在41 bp重叠,重叠碱基数在 1～8 bp之间;基因间隔序列共计21处 126 bp,间隔长度从 1～20 bp不等,最大的基因间隔是20 bp,是在tRNALys 和 ATP8 基因之间.还对lrRNA和srRNA二级结构进行了预测,同时也对tRNA反密码子臂的碱基对类型以及不同链上蛋白编码基因的A/T,C/G组成偏向性进行了详细的讨论.     

虾虎鱼类线粒体全基因组序列结构特征分析及系统发育关系探讨

虾虎鱼类体态变异大、体型小、种类多, 形态鉴定及谱系分类较为困难。为深入开展虾虎鱼类的鉴定、分类及遗传进化等研究, 文章对已获得的26种虾虎鱼线粒体全基因组进行分析。结果发现, 虾虎鱼类线粒体基因组的基因组成及排列模式与大多数脊椎动物线粒体基因组特征基本一致; 由于不同物种的控制区存在不同数量的重复序列而导致基因组序列长度存在明显的差异; 26种虾虎鱼线粒体全基因组序列及不同基因中A+T的含量均超过50%, 并存在碱基G偏倚现象。基于37个编码基因序列, 利用Kimura双参数法计算遗传距离, 发现矛尾刺虾虎鱼与斑尾刺虾虎鱼、斑纹舌虾虎鱼与钝吻舌虾虎鱼分别为同种异名。通过对26种虾虎鱼线粒体基因组控制区序列的比较, 识别了终止结合序列区、中央保守区及保守序列区。利用26种虾虎鱼线粒体基因组的36个编码基因序列构建系统发育树, 发现部分聚类结果不同于传统的形态学分类方式, 虾虎鱼科中的5个亚科出现了明显的分化, 近盲虾虎鱼亚科、背眼虾虎鱼亚科、瓢虾虎鱼亚科亲缘关系较近而聚成一大支, 然后与拟虾虎鱼亚科种类形成姐妹类群, 虾虎鱼亚科与其它的4个亚科亲缘关系较远, 单独成为一个类群。根据分子钟估算结果推测虾虎鱼科物种可能起源于始新世晚期至渐新世时段, 在中新世进一步分化为具有现代表征的虾虎鱼种类。     

池蝶蚌线粒体基因组全序列分析

采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接首次获得了池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为15939 bp,由13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个SrRNA基因和28个长度为1393 bp的非编码区组成;除ND3-ND5、ND4L、ATP6、ATP8、COX1-COX3、tRNA-D、tRNA-H之外,其他大多数基因在L链编码。池蝶蚌线粒体全基因组序列、蛋白编码基因、tRNA基因、rRNA基因及非编码区的A+T含量分别为60.36%、59.84%、61.7%、60.23%及62.5%,与其他淡水蚌类一致,均表现出A+T偏好性,淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现在非编码区长度的差异。池蝶蚌mtDNA的COX2-12SrRNA区域基因排列存在差异,是ND3、tRNAHis、tRNAAla、tRNASer1、tRNASer2、tRNAGlu、ND2、tRNAMet 8个基因发生重组造成。22个tRNA基因都具有典型的三叶草二级结构,tRNA-E与 tRNA-W间的非编码区含有一个ORF区,而控制区并未发现。从GenBank上下载的14种双壳纲贝类的mtDNA序列构建的系统进化树,显示池蝶蚌与三角帆蚌亲缘关系最近。研究结果为淡水珍珠蚌线粒体基因重排及进化特征提供理论依据。       

叶蝉线粒体基因组全序列结构研究进展

叶蝉种类多,数量大,并且广泛分布于全世界,主要生活在森林和草地上,均以植物为食,对蔬菜、禾谷类等经济植物产生危害。迄今,在NCBI中已收录27种叶蝉线粒体基因组全序列数据。本文概述了叶蝉线粒体基因组全序列的获取过程和分析方法,并且比较了PCR法和NGS在实际测序应用中的优缺点;从开展时间和研究空间两方面梳理了叶蝉线粒体基因组全序列研究现状;分析了27种叶蝉全序列结构的基因重叠、基因偏斜、PCGs基因、密码子使用、RNA基因和A+T富含区的基本特征;总结了叶蝉线粒体基因组在系统发育关系、分类鉴定以及不同地理种群之间的应用;同时基于以上研究,从研究数量、研究体系和研究应用三方面归纳了叶蝉线粒体基因组全序列现阶段研究中的不足,并对今后的研究工作予以展望。     

桔小实蝇线粒体基因组全序列及其分析

桔小实蝇Bactrocera dorsalis线粒体基因组全序列对研究实蝇分子系统进化具有重要意义。本研究通过DNA测序和克隆技术,对桔小实蝇mtDNA全序列进行了测定和分析。结果表明：桔小实蝇线粒体基因组全长15 915 bp（GenBank序列号: DQ845759）。基因组碱基组成为39.3%A,16.2%C,10.2%G,34.3%T,由13个蛋白编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因以及一个非编码的控制区域（A+T-rich区）组成。7个蛋白编码基因和13个tRNA基因从J链编码,其余6个蛋白编码基因和9个tRNA基因从N链编码。位于J链上的蛋白编码基因具有近似的A、T含量,而位于N链上的蛋白编码基因的A的含量明显高于T的含量。以mtDNA COⅠ基因为例,比较了桔小实蝇与其他14种实蝇的亲缘关系,结果显示其与同亚属（果实蝇亚属Bactrocera）内的其他近缘种相互间的同源性很高。