CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

CRISPR/Cas9基因组定点编辑中脱靶现象的研究进展

近年来, CRISPR定点编辑技术发展迅猛, 在动物、植物和微生物中均得到广泛应用。其中, 备受关注的脱靶现象也是研究的热点, 迄今已取得了重要进展。该文介绍了脱靶现象的产生原理及体内和体外检测脱靶现象的方法, 评价了通过改进sgRNA设计和优化CRISPR系统等来降低脱靶率的方法。在植物基因组定点编辑过程中, 应适时检测脱靶现象, 提高脱靶检测的精确度和准确度。     

机器学习方法在CRISPR/Cas9系统中的应用

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组定点编辑技术,已被广泛应用于基因编辑和基因表达调控等研究领域。如何提高该技术对基因组编辑的效率与特异性、最大限度降低脱靶风险一直是该领域的难点。近年来,机器学习为解决CRISPR/Cas9系统所面临的问题提供了新思路,基于机器学习的CRISPR/Cas9系统已逐渐成为研究热点。本文阐述了CRISPR/Cas9的作用机理,总结了现阶段该技术面临的基因组编辑效率低、存在潜在的脱靶效应、前间区序列邻近基序(PAM)限制识别序列等问题,最后对机器学习应用于优化设计高效向导RNA (sgRNA)序列、预测sgRNA的活性、脱靶效应评估、基因敲除、高通量功能基因筛选等领域的研究现状与发展前景进行了展望,以期为基因组编辑领域的研究提供参考。     

快速构建多重sgRNA载体利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥IAA2基因

IAA2(Indole Acetic Acid 2)是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员,目前还没有它的突变体的报道,阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。在CRISPR/Cas9基因组编辑技术中,1个sgRNA只能靶向基因的1个位点,有时基因敲除的效率并不高。为了提高敲除效率,本文在Golden-Gate克隆技术的基础上,通过两轮PCR扩增,将每3个sgRNA串联到同1个入门载体中,再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应,获得最终的表达载体。结果表明,设计的6个sgRNA有4个发挥了作用,产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与单个sgRNA相比,多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多;与其他构建多重sgRNA载体的方法相比,本方法具有快速、高效等优点。本文所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料。     

CRISPR基因编辑的脱靶效应应对策略综述

CRISPR/Cas9基因编辑系统是第三代基因编辑技术,在生物医学领域有着广泛的应用。该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成,sgRNA与Cas9结合并引导Cas9到达DNA靶点,Cas9作为核酸内切酶对靶序列进行切割,形成DNA双链断裂(double strand break, DSB)。DSB通过两种机制——非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重组介导的修复(homology-directed repair, HDR)——进行修复,实现特定基因的敲除或插入。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑工具相比,CRISPR/Cas9在简便性、专一性等方面有很大优势,但脱靶效应一直是它在实际应用中面临的一个难题。目前已有许多针对脱靶效应的研究,科学家们已发现一些影响靶点专一性的因素,如sgRNA种子序列、PAM序列、Cas9蛋白、DSB修复通路等,并据此研发出降低脱靶效应的可行性策略。本综述就CRISPR/Cas9系统的作用原理、潜在的脱靶危害和降低脱靶效应的策略研究进行阐述。     

酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用*

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值。方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率。随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响。首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率。结果:酵母培养144~192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低。根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%~28%。结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比。sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性。两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR associated proteins)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御病毒或质粒入侵的获得性免疫系统.目前已发现的CRISPR/Cas系统包括Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ型,其中Ⅱ型系统的组成较简单,由其改造成的CRISPR/Cas9技术已成为一种高效的基因组编辑工具.自2013年CRISPR/Cas9技术成功用于哺乳动物基因组定点编辑以来,应用该技术进行基因组编辑的报道呈现出爆发式的增长.农业动物不仅是重要的经济动物,也是人类疾病和生物医药研究的重要模式动物.本文综述了CRISPR/Cas9技术在农业动物中的研究和应用进展,简述了该技术的脱靶效应及减少脱靶的主要方法,并展望了该技术的应用前景.     

CRISPR/Cas9系统在昆虫中的应用

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种RNA引导的基因组靶向编辑技术,能对基因组序列进行精确编辑,在探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因、改良品质性状等方面具有广阔的应用前景。近年来,随着对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入和改造,该系统以其操作简易、省时、高效等优点在生物学研究的众多领域中得以推广和应用,特别是在果蝇(Bombyx mori)、家蚕(silkworm)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和蝴蝶(butterfly)等多种昆虫中。本文概述了CRISPR/Cas9的结构、作用原理及发展优化,总结了CRISPR/Cas9导入昆虫的策略和在昆虫中的应用,以及对CRISPR/Cas9系统产生脱靶问题的应对策略,以期对经济昆虫和有益昆虫的分子育种、害虫的生物技术防控等研究提供参考。     

CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用

CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统,用来抵抗外来病毒或质粒的入侵。近几年,由Ⅱ型CRISPR/Cas适应性免疫系统改造而来的CRISPR/ Cas9基因组编辑技术蓬勃发展,被广泛地应用于生命科学研究的各个领域,并取得了革命性的变化。文章主要综述了CRISPR/Cas9基因组编辑技术的起源与发展及在生命科学各研究领域的应用,重点介绍了该系统在人类疾病基因治疗方面的最新应用及脱靶效应,以期为相关领域的科研人员提供参考。     

sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing

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Cas9/sgRNA递送技术及其研究进展

在与CRISPR/Cas9基因编辑技术相关的临床应用中,Cas9/sgRNA的递送是决定基因编辑治疗效果的关键技术之一。无需转录和翻译过程的Cas9蛋白/sgRNA复合物直接递送形式可能能够提供更高的特异性和安全性。文中通过对Cas9/sgRNA递送技术的研究现状及其在基因相关疾病治疗中的进展进行简要综述,为新型药物载体的设计和基因治疗的临床应用提供新思路。