T-DNA转移研究进展

植物遗传转化技术近年在农作物性状改良、植物生物反应器利用以及基因功能鉴定等方面得到了广泛的应用.T-DNA转移是植物细胞农杆菌介导遗传转化整合和表达外源基因的基础.农杆菌Ti质粒vir基因编码蛋白、农杆菌一些染色体基因编码蛋白及植物细胞一些基因编码蛋白或因子均参与T-DNA转移.转移过程包括农杆菌对植物细胞的识别、附着,细菌对植物信号物质的感受,细菌vir基因的诱导表达,T复合体的形成,跨膜运输,进核运输和整合等一序列过程.植物细胞因子与农杆菌T-DNA转移相关蛋白的相互作用最近被认为在T-DNA转移过程中起重要作用.     

4种寄主植物对烟粉虱发育、存活及繁殖的影响

在实验室条件下[温度(26±1)℃,相对湿度(75±5)%,光照L∶D=14∶10],对烟粉虱[Bemisia tabaci(Gennadius)]在烟草、假连翘、一品红、扶桑等4种寄主植物上的发育、存活、繁殖力及若虫个体形态进行了研究。结果表明:烟粉虱在上述4种寄主植物上从卵至成虫的发育历期分别为:17.63、25.70、23.15、20.32 d,存活率为:62.63%、58.48%、43.69%、52.45%。烟粉虱在烟草、假连翘、一品红、扶桑上的单雌产卵量分别为337.80、307.40、157.00、57.20粒,种群增长指数(I)分别为117.95、107.86、37.86、16.24。     

寄主植物叶片物理性状对潜叶昆虫的影响

潜叶昆虫广泛分布于鳞翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目中,其幼虫潜入叶片内部生活和取食,是一类用于研究植物-昆虫-天敌种间关系和协同进化的重要模式生物。有些潜叶昆虫是重要农林害虫。相比外食性昆虫,在叶内取食的潜叶昆虫幼虫更易受到叶片物理性状的直接影响。叶片的着生位置、朝向、大小、颜色和表皮毛等直接决定潜叶虫成虫的取食和产卵选择,从而影响幼虫的空间分布和寄主适应。叶片的某些物理性状也会直接影响幼虫的取食行为、生长发育和被寄生率。研究叶片物理性状的防御作用以及潜叶昆虫对这些防御的适应,有助于了解潜叶昆虫-寄主植物的协同进化。另一方面,外界环境和遗传育种都有可能改变植物叶片的物理特性,而对潜叶害虫产生抗性,从而实现潜叶害虫的可持续生态控制。     

寄主植物的功能性状对桑寄生寄主专一性的影响初探

为探讨寄主多样性和寄主功能性状对桑寄生植物的寄主专一性的影响,调查了西双版纳热带植物园内桑寄生和寄主植物种类。结果表明,桑寄生植物共有2科5属6种1变种,感染隶属于58科190属286种寄主植物1 323株。桑寄生在不同生境的寄生强度具有极显著差异(P0.01),单一种植园的寄生强度最高,而在森林的分布最少。不同种类桑寄生的寄主范围存在较大差异,专一性程度(H′)为1.92～7.05,多度较高的植物更容易被感染。冗余分析表明,寄主植物的胸径、树皮含水量和树皮粗糙度对不同桑寄生的寄主利用差异有显著影响,而木质密度和树皮pH的影响不显著。因此,不同种类桑寄生在热带植物群落的寄主专一性程度有较大差异,对寄主植物特定功能性状的偏好能解释部分差异。     

高等植物的遗传转化

自1944年Avery首次阐明肺炎双球菌的遗传转 化机理后,人们一直在探索适合高等植物的转化途径, 但早期用DNA直接处理种子或细胞均未取得成功。,。 197;年,Van LarebekeEs',等在根癌农杆菌中发现一 种与双子叶植物肿瘤诱导有关的质粒,即Ti质粒‘ 1977年ChiltonL",等用限制性内切酶谱法证明,在植 物的冠廖瘤组织中存在农杆菌Ti质粒的一个片段,称 为转移DNA (T-DNA), T-DNA在植物基因组中的 整合和表达导致肿瘤的发生。此后以Ti'质粒为基础 的植物遗传转化研究获得迅速发展,在理论和应用方 面均取得很大成就“,‘。本文主姿对植物转化的机理 和方法进行综述。     

T-DNA转移及整合的分子机制研究进展

农杆菌介导的外源基因转化是目前植物转基因应用比较广泛的方法。近年来关于农杆菌介导的整合机制的研究已经取得了很大的进步。研究表明,在VirD2和VirE2协助下,农杆菌转移T-DNA进入植物细胞,这两种蛋白共同协助T-DNA完成转移、核定位及在植物基因组中的整合。近年来关于拟南芥突变体的研究表明,被转化植物的宿主基因在T-DNA转移及整合过程中发挥主要的作用。通过对现有研究成果详细讨论了Vir’蛋白(VirD2和VirE2)及植物基因在农杆菌介导植物转化中的作用,详细讨论了依靠VirD2蛋白和SDSA(synthesis-dependent strand-annealing)整合的两类不同的整合模式,根据最新的研究成果阐述了以基因组的双链断裂修复为基础的整合模型,并提出新的观点。     

根癌农杆菌介导的轮枝镰孢菌遗传转化及T-DNA插入突变体的筛选

建立并优化了农杆菌介导转化轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides获得T-DNA插入突变体的体系,在镰孢菌孢子浓度106个/mL、农杆菌OD600=0.15-0.20、乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL的条件下共培养36h转化率最高,可达60-120个/106个孢子。共获得转化子1000多个,连续转接5代能够稳定遗传。PCR验证潮霉素B抗性基因已整合进转化子基因组DNA中,部分转化子表现为生长和形态异常。该转化体系的建立为研究该菌的致病机制和功能基因分析奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的轮枝镰孢菌遗传转化及T-DNA插入突变体的筛选

建立并优化了农杆菌介导转化轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides获得T—DNA插入突变体的体系,在镰孢菌孢子浓度10^6／mL、农杆菌OD600=0．15—0．20、乙酰丁香酮浓度为200μmol／mL的条件下共培养36h转化率最高,可达60—120个／10^6个孢子。共获得转化子1000多个,连续转接5代能够稳定遗传。PCR验证潮霉素B抗性基因已整合进转化子基因组DNA中,部分转化子表现为生长和形态异常。该转化体系的建立为研究该菌的致病机制和功能基因分析奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的轮枝镰孢菌遗传转化及T-DNA插入突变体的筛选

建立并优化了农杆菌介导转化轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides获得T-DNA插入突变体的体系,在镰孢菌孢子浓度106个/mL、农杆菌OD600=0.15-0.20、乙酰丁香酮浓度为200μmol/mL的条件下共培养36h转化率最高,可达60-120个/106个孢子。共获得转化子1000多个,连续转接5代能够稳定遗传。PCR验证潮霉素B抗性基因已整合进转化子基因组DNA中,部分转化子表现为生长和形态异常。该转化体系的建立为研究该菌的致病机制和功能基因分析奠定了基础。     

T-DNA插入突变在植物功能基因组学中的应用

T-DNA插入突变在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用,广泛应用于大规模植物基因功能分析,是分离新基因、研究基因功能的有效工具。我们简单介绍了T-DNA插入突变的原理,详细论述了3种T-DNA插入突变载体的应用,并综述了利用T-DNA插入突变克隆新基因的方法,同时指出了T-DNA插入突变存在的问题及其发展方向。     

Cell Surface Proteins of Agrobactevium tumefaciens Involved in the Transfer of T-DNA to the Host

We investigated the taste synergy between L-theanine and the flavour enhancer, inosine 5′-monophosphate (IMP), by using a human sensory evaluation. When L-theanine was added to IMP, only the umami taste was enhanced. We then investigated this synergistic effect of L-theanine in mice by gustatory nerve recording. We confirmed the synergism between L-theanine and IMP for the umami taste.     

提高水稻插入突变体库利用效率的尝试

T-DNA标签法是一种以农杆菌介导的遗传转化为基础来创造插入突变体库, 从而高通量地分离和克隆植物功能基因的方法。但由于种种原因, 水稻插入突变体库的利用效率较低。为了提高水稻插入突变体库的利用效率, 结合水稻一个双拷贝T-DNA插入突变体的发现和鉴定研究, 通过特异PCR检测、侧翼序列与目标性状的共分离分析, 在1个双插入位点均为杂合的植株的后代株系中分拆了2个插入事件, 分离出目标性状存在遗传分离且只带有1个插入事件的后代株系, 为后续的共分离检测和基因克隆研究打下了重要的基础。由此产生了对插入突变体库中的非串联多拷贝插入标签系进行研究的一些思路和方法, 提出来与同行商榷。     

稻瘟菌突变体T-DNA插入位点的精细定位和插入模式的研究

随机挑取已构建的37个稻瘟菌T-DNA突变株,利用TAIL-PCR技术扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列,测序并进行比对分析。结果显示:成功获得扩增产物并测序的序列共有39条,T-DNA边界序列为稻瘟菌序列的有19条,其余20条为载体主干序列。在这有效扩增为稻瘟菌序列的19条中,有10条是T-DNA右侧翼序列与稻瘟菌序列,9条为左侧翼序列加稻瘟菌序列。分析T-DNA剪切位点,10条右侧翼序列中有9条的剪切位点相同,这与农杆菌介导T-DNA转化植物一样。而左边界的剪切位点就没有这种规律性。研究也精细确定了17个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研究奠定基础。     

Sequence context of the T-DNA border repeat element determines its relative activity during T-DNA transfer to plant cells

Summary We present a detailed analysis of the function of the right and left T-DNA border regions of the nopaline Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. An avirulent deletion of the right border of the nopaline Ti plasmid (pGV3852) was used as an acceptor for 14 different T-DNA border constructs. The functional activities of these constructs were assayed by their ability to restore virulence, i.e. transformation on inoculated plants. Tumorigenicities were measured in several independent experiments over a 2 year period and the statistical significance of their relative levels was evaluated. The data indicate: (i) the entire sequence of the 25 bp direct repeat of the T-DNA is required to provide an efficient substrate for mediating T-DNA transfer events; deletion derivatives of either the conserved or the vaiable domain of the repeat are defective in T-DNA transfer; (ii) while the 25 bp direct repeat alone can promote the T-DNA transfer, the flanking sequences of the repeats enhance (on the right) or attenuate (on the left) their activity; and (iii) tumorigenicity measurements vary depending on the plant assay system: potato discs are more sensitive than wounded tobacco leaves in detecting differences in T-DNA border activity.     

T—DNA介导的基因诱捕技术及其在植物功能基因组学研究中的应用

T-DNA介导的基因诱捕技术是近年来发展起来的鉴定和分离基因的方法。在拟南芥和水稻基因组测序已经完成的今天,该技术将在两者基因功能的研究中扮演举足轻重的角色。本文就T—DNA介导的基因诱捕系统、基因克隆和突变体库构建的研究进展及其在植物功能基因组学上的应用等内容进行了综述,并讨论了该技术应用中的一些问题。     

A plant transformation vector with a minimal T-DNA II. Irregular integration patterns of the T-DNA in the plant genome

A minimal T-DNA binary vector was used for Agrobacterium-mediated transfer of a chimeric T4 lysozyme gene located next to the left border, and transgenic potato plants which expressed T4 lysozyme protein were identified and further analysed. Frequent rearrangements of T4 lysozyme transgenes were detected. A vector derivative containing two matrix associated regions (MARs) flanking its multiple cloning site was constructed. In transgenic potato plants, reduced variability in gene expression due to position effects was detected. When either the donor vector contained MAR sequences, or when vector pPCV701 which contains a pBR322 fragment next to the left border were used, only relatively few rearrangements were observed. However, when the T4 lysozyme gene was driven by a CaMV 35S promoter modified by multiplied enhancer region carrying either 2 or 4 elements, frequent rearrangements were again obtained.     

Factors affecting the rate of T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Nicotiana glauca plant cells

Different factors involved in the early steps of the T-DNA transfer process were studied by using a -glucuronidase gene (gusA) as a reporter in Nicotiana glauca leaf disc transformation experiments. The levels of transient expression of the gusA gene in leaf discs infected with several strains or vir mutants correlated well with their virulence phenotype, except for virC mutants. The rate of T-DNA transfer was shown to be stimulated in the case of non-oncogenic strains by the co-transfer of small amounts of oncogenic genes. It was found that the location of the T-DNA in the Agrobacterium genome affected the T-DNA transfer rate especially in virC mutants. The virC mutants transferred the gusA-containing T-DNA located on a binary vector more efficiently than the oncogenic T-DNA of the Ti plasmid. Although wild-type strains induced high levels of gusA expression early after infection, the gusA expression appeared to be lost late after infection in the infected leaf discs. In contrast, in leaf discs infected by virC mutants the level of gusA expression increased steadily in time. A model explaining these results is presented.