α—银环蛇毒素基因的合成与表达

结合国内外的研究现状,以α－银环蛇毒素为例来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α－银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其ＤＮＡ序列并设计成部分互补的４条寡核苷酸片段,利用ＤＮＡ合成仪人工合成,纯化这４条寡核苷酸片段,通过片段退火,切口补平,连接,克隆,测序鉴定获得了α－银环蛇毒素基因,然后将ａ－银环蛇毒素基因克隆至ｐＧＥＸ－２Ｔ质粒中分别转化ＤＨ５α和     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化.采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品.首先从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品.然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性.ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g.结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的.     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

α-银环蛇毒素基因的克隆及其非融合型原核表达研究

根据文献报道α－银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段。经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经XbaI和EcoRI双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化BL21（DE3）、BL21（DE3）Codonplus、BL21（DE3）plysS进行诱导表达,表达产物经Tris/tricine系统进行SDS-PAGE分析。结果表明：该基因已在大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中进行了非融合表达,其表达量占细菌总蛋白的11.98％,主要以包涵体形式存在;同时对表达条件进行了优化,其表达量可达16.28%。经Westernblot分析,在大约8kDa处出现明显的目的带,与预计蛋白分子量大小一致,说明表达产物与天然α-银环蛇毒素具有相似的免疫原性。表达产物纯化、复性后经动物毒性试验表明：表达的α-银环蛇毒素蛋白具有生物学活性,小鼠腹腔注射其LD50约为1.28μg/g。     

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α-银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α-银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α-银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX-4T-1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒α-BgTX(P22-A31)／pGEX-4T-1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30％,可溶形式存在的融合蛋白大于25％。     

垂体腺苷酸环化酶激活肽基因的合成表达与活性研究

根据文献报道垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)的氨基酸序列,推导出其核苷酸序列并设计成部分互补的6条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化这6条寡核苷酸片段,通过片段退火、连接、克隆及测序鉴定获得了PACAP基因.将PACAP基因克隆至pGEX-4T-3质粒中转化BL21进行表达分析,融合蛋白约占细胞总蛋白的30％,其中部分为可溶性,部分以包涵体形式存在.通过亲和层析纯化GST-PACAP融合蛋白,该蛋白质能促进PC12细胞轴突生长及脊髓神经元存活.     

垂体腺苷酸环化酶激活肽基因的合成表达与活性研究

根据文献报道垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)的氨基酸序列,推导出其核苷酸序列并设计成部分互补的6条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化这6条寡核苷酸片段,通过片段退火、连接、克隆及测序鉴定获得了PACAP基因.将PACAP基因克隆至pGEX-4T-3质粒中转化BL21进行表达分析,融合蛋白约占细胞总蛋白的30％,其中部分为可溶性,部分以包涵体形式存在.通过亲和层析纯化GST-PACAP融合蛋白,该蛋白质能促进PC12细胞轴突生长及脊髓神经元存活.     

BjαIT的表达、抗血清制备及scFv基因库的构建

根据成熟昆虫神经毒素BjαIT的氨基酸序列,人工合成毒素基因,并克隆至大肠杆菌表达载体pPET-30a（＋）。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化,纯化蛋白免疫BALB／c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度达1：512,000。提取免疫小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR分别扩增重链可变区（VH）及轻链可变区（VL）基因片段,在连接肽linker的连接下成功构建了包含抗BjαIT的全长scFv基因库。本研究为新型蝎昆虫神经毒素BjαIT的检测奠定了基础。     

蛇神经毒素的表达和鉴定

抽提中华眼镜蛇毒腺总RNA,通过反转录PCR扩增Cobrotoxin cDNA,克隆并测序。该cDNA编码83个氨基酸,包括21个氨基酸的信号肽和62个氨基酸的成熟蛋白。该成熟蛋白的氨基酸序列和通过蛋白测序从台湾眼镜蛇鉴定的Cobrotoxin完全一致。PCR扩增编码Cobrotoxin的DNA,并亚克隆到表达载体pMAL-P₂。此外,通过合成寡核苷酸片段,拼接成完整的CM11基因,并将其克隆至pMAL-P₂。经IPTG诱导,两种神经毒素基因在大肠杆菌中都得到高效的可溶性融合表达。表达产物通过SDS-PAGE和蛋白印迹杂交加以鉴定。表达的融合蛋白经过Sepharose 6Bamylose亲和色谱和DEAESepharose FF离子交换色谱得到有效纯化。经Xa因子酶切后得到的两种重组神经毒素都具有小白鼠体内毒性。     

B型肉毒毒素保护性抗原Hc在大肠杆菌中的可溶性高表达

目的：通过序列优化及表达条件改进,在大肠杆菌中高效可溶性表达B型肉毒毒素保护性抗原He（Bont／B-He）。方法：对Bont／B-He基因片段优化,用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子,并将（C＋C）含量由76．2％降至56-3％;人工合成多条具有重叠互补序列的寡核苷酸片段,采用重叠延伸PCR方法获得了Bont／B-He的全长基因,并构建了原核可溶性表达载体;将经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）感受态细胞,用IPTC诱导Bont／B-He的表达并进行纯化及Western印迹鉴定。结果和结论：目的蛋白在大肠杆菌B121（DE3）中获得了可溶性高表达,占菌体裂解液上清总蛋白的26．7％,表达量达到30mg／L,是目前国内外已知表达的最高水平;经Ni柱一步纯化后,目的蛋白纯度可达到80.3％,为肉毒毒素中和抗体的制备及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

重组α-银环蛇毒素P22-A31的原核表达及功能分析

α-银环蛇毒素在神经科学研究以及在临床和制药上有重要作用,为获得大量的α-银环蛇毒素,我们用已构建的pGEX-BgTX(P22-A31)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并用谷胱甘肽Sepharose FF纯化GST-α-银环蛇毒素融合蛋白,再用凝血酶切掉融合标签谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST),得到了较纯的重组α-银环蛇毒素同工毒素,得率约为1.225mg/L。用重组α-银环蛇毒素制备多克隆抗体,经ELISA和Western杂交鉴定后可知重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素的抗原性一致。小鼠毒性试验表明,重组α-银环蛇毒素同工毒素的半致死剂量LD50为1.598mg/kg,约为天然α-银环蛇毒素的1/5。小鼠化学法镇痛试验显示,重组α-银环蛇毒素有一定的镇痛药效,1/4LD50剂量的镇痛百分率为55.2%,1/8LD50剂量的镇痛百分率为20.5%,在外周镇痛作用中呈一定的量效关系。     

银环蛇神经毒素的分子克隆和功能表达(英文)

抽提银环蛇毒腺总ＲＮＡ,通过反转录ＰＣＲ技术扩增出其神经毒素ｃＤＮＡ,克隆并测定了全序列。银环蛇神经毒素的ｃＤＮＡ编码２１个氨基酸的信号肽和７４个氨基酸的成熟蛋白。该信号肽非常类似于短链神经毒素、κ－神经毒素和心脏毒素的信号肽。而成熟蛋白的氨基酸序列与从台湾产银环蛇中通过蛋白测序鉴定的α－ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ的氨基酸序列完全一样。此外,还克隆到该神经毒素缺失前体ｃＤＮＡ。利用麦芽糖结合蛋白融合     

蛇毒神经毒素类似物的免疫学分析

选取眼镜蛇蛇毒和银环蛇蛇毒中 1 0个差异较大的神经毒素类似物 ,通过麦芽糖融合表达系统使它们在大肠杆菌中得到高效可溶性表达 .通过 Amylose- Sepharose6B亲和树脂纯化这些融合蛋白 .分别制备这 1 0种融合蛋白多克隆抗体 .同时将这 1 0种神经毒素类似物进行硫氧还蛋白融合表达 ,表达产物基本上都是包涵体 .以硫氧还蛋白融合表达产物为抗原和上述 1 0种神经毒素类似物抗血清进行 Western blotting.结果显示 ,大多数神经毒素类似物之间没有免疫交叉反应 ,表明这些神经毒素类似物的抗原性差别较大 ,可能存在不同的分类和进化     

死亡肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将人工合成的寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到死亡肽（thanatin）基因,并将其克隆到表达载体pGEX-3X中,序列分析结果正确。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行高效可溶性表达,表达量可达20%以上。融合蛋白通过GST亲和层析纯化,用肠激酶酶解表达产物,用Sephadex G-25初步纯化得到具有抗菌活性的死亡肽。     

两个蛇毒基因克隆及cDNA序列多态性再分析

α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)是一种突触后神经毒素,广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中,对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列,并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照,从同一次反转录得到的cDNA混合物中,克隆了蛇毒神经生长因子cDNA,并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况,发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化,因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来,同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况,因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。     

两个蛇毒基因克隆及cDNA序列多态性再分析

摘要：α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）是一种突触后神经毒素，广泛存在于眼镜蛇科蛇类的毒腺中，对于该基因cDNA多态性是否真实一直存有争议。本研究从银环蛇基因组DNA中克隆到α-银环蛇毒素基因序列，并对其中5个克隆进行测序和序列比对分析。作为参照，从同一次反转录得到的cDNA混合物中，克隆了蛇毒神经生长因子cDNA，并对其进行测序、比对和突变情况分析。综合各研究组报道的α-银环蛇毒素cDNA序列、α-银环蛇毒素基因序列和神经生长因子cDNA序列的突变情况，发现α-银环蛇毒素cDNA的多态性在基因组模板上不存在对应的变化，因此推测这种多态性不是从不同的转录本而来，同时考虑到不同研究小组报道的序列突变位点并没有出现相同的情况，因此其多样性也不是RNA编辑的结果。可见这种cDNA序列上的多样性很可能是由反转录过程以及基因克隆过程中人为引入的错误造成的。     

炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体的构建

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR_1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。     

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKXI原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白.方法:根据GenBank中的TaCKXI序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKXl编码基因的批pMD-QRCKXI重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKXI基因的DNA片段.将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKXI已构建成功.提取per-TaCKXI质粒转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件.结果:在大肠杆菌中获得TaCKXI基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.91kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5.2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大.选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白.经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白.结论:小麦TaCKXI基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKXI蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础.     

炭疽毒素保护性抗原第四结构域在大肠杆菌中的可溶性表达

人工优化设计并合成炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并与噬菌体gⅢ蛋白N端结构域基因融合,在大肠杆菌中可溶性表达融合蛋白。结果表明合成了炭疽毒素保护性抗原第四结构域基因,并在大肠杆菌中获得了高效可溶性融合表达,可溶性表达产物占细菌总蛋白量的36％左右;经亲和层析纯化获得了重组蛋白;Western印迹分析表明,表达产物能与His单抗（重组蛋白羧基端带有6xHis）发生特异性结合反应。以上结果表明获得了炭疽毒素保护性抗原第四结构域,为利用人抗体库进行筛选抗炭疽毒素的人源性中和抗体奠定了基础。     

家蚕抗菌肽CMIV基因结构改造及表达产物的研究

参照天然抗菌肽ＣＭＩＶ组分的氨基酸序列,作了近５０％的改动,根据大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成了抗菌肽基因片段．将人工合成的抗菌肽类ＣＭＩＶ基因先重组到测序载体ｐＵＣ１１８上,经过序列分析,发现克隆于载体ｐＵＣ１１８上的基因片段与设计的序列完全一致．再将该基因片段重组到表达载体ｐＥＴ２８（ａ）上,抗菌肽以融合蛋白的形式表达．融合蛋白经镍－金属离子胶亲和层析纯化后,再用ＣＮＢｒ裂解,最终产物具有与天然抗菌肽相同的生物学活性