人淋巴毒素基因的分子克隆及其物理图谱

本文报道用一种简便、快速并省时的方法——体内同源重组⑴,以小鼠淋巴毒素 (MuLT)cDNA为探针,从以粘粒pcos2EMBL为载体构建成的人基因组文库中分离出人淋巴毒素(HuLT)基因。然后,以同位素³²P标记重组粘粒的cos单链末端⑵,再将经限制酶部份酶切的这种重组粘粒DNA片段电泳分部后,制作出HuLT基因的EcoR I、BamH I、PstⅠ和PvuⅡ四种限制性内切酶的物理图谱。     

调节性T细胞通过RANKL-RANK信号通路介导乳腺癌转移

炎症会影响肿瘤的发生和转移。有证据表明前列腺癌的转移与两个TNF家族成员有关,RANKL和淋巴毒素。而RANKL和他的受体RANK又可在妊娠时期通过IKK-a(一个与乳腺细胞更新和前列腺癌转移有关的蛋白激酶)控制炎症小叶肺泡细胞的增殖。于是作者通过RANK基因的敲除或RANKL的添加证明了RANK/RANKL信号通路可以促进乳腺癌的转移。之后,作者发现RANK信号通路与原癌基因Erbb2的过表达有关,而这个基因在乳腺癌中会大量出现。由于在乳腺癌引起的炎     

生物工程技术讲座(七)

向细胞内引入高分子物质二、磷酸钙法把DNA分子或病毒核酸用特殊方法引进培养细胞,研究细胞出现的新性质,是70年代以来被广泛应用的分子生物学技术。应用这种方法的目的在于:①了解和分析DNA(基因)在生物体细胞内的生物活性、结构功能、表达动态以及进一步探     

真核表达猪白细胞介素17及其生物活性研究

目的:为真核表达猪白细胞介素17(IL-17),研究产物在细胞培养下的免疫生物活性。方法:通过PCR扩增出猪IL-17基因并插入到真核表达载体p VAX1,然后转染到IPEC-J2细胞、Ha Ca T细胞和L02细胞中。在转染后第24、48和72h收集细胞,第48h收集上清液。收集细胞通过实时荧光定量PCR检测相关免疫基因的表达水平,收集上清液通过抑菌试验检测相关抗菌肽的生物活性。结果:采用p VAX1载体构建了表达猪IL-17的重组质粒,转染到细胞中。证实IL-17基因能诱导抗菌肽基因(RegⅢ、S100A8和BD2)的表达,显著上调JAK-STAT信号通路基因(JAK1、STAT1和STAT3)和细胞因子基因(IL-6、IL-12和TNF-α)的表达。此外,细胞上清液能够在不同程度上抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的增殖。结论:成功将猪IL-17基因真核表达,其表达产物能诱导效应细胞表达多种细胞因子,产生多种抗菌肽,具有抑菌能力;这为进一步研发猪IL-17作为抗菌免疫分子制剂奠定了初步基础。     

NF-κB信号通路与炎症反应

核转录因子kappaB(NF-κB)是细胞中重要的转录调节因子,通常以p50-p65异二聚体的形式与其抑制性蛋白(inhibitor kappaB,IκB)结合而呈非活化状态。NF-κB通过刺激因子(病毒、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子、淋巴毒素等)的活化进而诱导多种基因的表达,产生多种细胞因子参与炎症反应。NF-κB通过复杂的分子调节参与机体的慢性炎症反应并产生一定的生理变化。本文阐述了NF-κB介导炎症反应的过程及相关研究进展。     

一种新的淋巴因子——白细胞调节素

白细胞调节素能直接特异地防止细胞癌变,抑制癌前细胞及癌细胞的生长,溶解癌细胞,增强癌细胞对自然杀伤(NK)细胞的敏感性,在医学临床上具有重要意义。文章详细介绍了白细胞调节素不同于干扰素、肿瘤坏死因子、淋巴毒素、和自然杀伤细胞毒因子,及其近年来的研究进展。     

BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效.为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响.结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长;ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL).结果表明,BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.     

BiP表达下调改善双载体转断裂FVIII基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效. 为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响. 结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长; ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL). 结果表明, BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.     

脂氧素与炎症的消退

脂氧素(lipoxin,LXs)又被称为脂肪氧合酶相互作用的产物,是在由损伤,感染,炎症等刺激引起的多细胞宿主反应中产生的,是含有三羟四烯结构的类花生酸类物质。LXs是第一个被确定和被克隆的类二十烷酸的并具有生物活性的內源脂质介质,是在体内细胞与细胞的相互作用中形成。目前许多研究发现,LXs能够调节多种炎症相关基因的表达和多种炎症细胞的功能,从而呈现出高效的的促炎症消退的作用。LXs这种独特的抗炎、促消退的功能,使得它成为近年来许多炎症研究的焦点。     

rhLTα衍生物的构建,细菌表达和纯化

应用ＰＣＲ方法,构建了Ｎ端缺失２７个氨基酸的重组人淋巴毒素α衍生物ｃＤＮＡ,将其插入表达载体后转化大肠杆菌并诱导表达。表达产物以包涵体形式存在,其量占菌体总蛋白的６０％～８０％。溶解包涵体,将产物复性并纯化后,其纯度达９５％以上。以小鼠Ｌ９２９细胞检测表达产物的细胞毒活性,比活性高于２×１０８国际单位每毫克蛋白质。抗人淋巴毒素的单克隆抗体能中和它的细胞毒活性。初步研究了这种人淋巴毒素衍生物的体外和体内抗肿瘤活性。     

An amplified insect dihydrofolate reductase gene contains a single intron

We have used methotrexate-resistant mosquito (Aedes albopictus) cells as the source of DNA for cloning an 8.5-kb EcoRI fragment containing an amplified dihydrofolate reductase (DHRF) gene. An estimated 1200 copies of the DHFR gene were represented in nuclear DNA from Mtx-5011-256 cells, which were 3000-fold more resistant to methotrexate than wild-type cells. Southern blot analysis indicated that all of the amplified DHFR genes were contained within a 1.8-kb AccI fragment represented in the cloned DNA. In contrast to mammalian DHFR genes which span approximately 30 kb, the complete amino acid coding sequence of the mosquito DHFR gene spanned 614 nucleotides, including a single 56-nucleotide intron that interrupted a conserved Arg codon at amino acid position 27. Additional introns characteristic of mammalian DHFR genes were absent; conservation of the first intron in the mosquito DHFR gene supports a regulatory role for this intron. The mosquito DHFR gene coded for a 186-amino-acid protein with 43-48% similarity to vertebrate DHFR.     

携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

Gene HI1472 of Haemophilus influenzae Rd is a novel gene involved in DNA repair

A chimeric plasmid, pJPuvr4, consists of a 16.7 kbp Haemophilus influenzae Rd chromosomal DNA insert at the EcoRI site of vector pJ1-8. This plasmid complements the UV and gamma ray sensitivity of the mutant strain MBH4. This plasmid carries the wild type allele of gene uvr4 which was localised to a 3.8 kbp DraI fragment, with an internal EcoRI site. Partial sequencing of the gene and its alignment with the published genome sequence of H. influenzae Rd revealed uvr4 to be HI1472. HI1472 is a putatively identified open reading frame (ORF), which has been assigned no function so far. The partial sequence did show nt database match with 3D exon of N cadherin gene of homosepians and moaA gene of H. influenzae. Cadherins are involved in cell adhesion, cell to cell contact and morphogenesis in homosepians and moaA gene codes for molybdenum biosynthesis subunitA. This report implicates HI1472 of Haemophilus influenzae Rd in DNA repair. Nucleotide sequence obtained for the gene uvr4 was compared with the published sequence of gene HI1472. A wild type strain variation was observed at the 592nd nucleotide position corresponding to a change from aspartic acid to threonine.     

钝顶螺旋藻luxAB载体的构建

实验拟构建钝顶螺旋藻luxAB载体,为螺旋藻遗传转化操作系统的建立提供技术参考和支持。使用EcoRI和SmaI双酶切质粒pUCΩGUS,胶回收获得含有Ubil启动子基因及amp基因的载体大片段;根据质粒pRL1063a中luxAB基因的序列设计引物,以质粒pRL1063a为模板（SalI酶切）,PCR扩增luxAB基因片段;在T4 DNA连接酶的作用下将载体大片段和luxAB基因片段进行体外连接重组并转化感受态细胞,构建成新型质粒载体pUCΩluxAB。     

CD真核表达载C 体的构建及在 2KHE39 细胞中的表达

目的：构建含自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）的真核表达载体pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD,并进行哺乳动物细胞HEK293转染研究。方法：以本实验室保存的含CD基因全长的质粒为模版,用PcR方法扩增CD基因阅读框序列,并定向克隆到带有HAtag的pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z载体上,使目的基因与HAtag在同一阅读框。重组体质粒经EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并对插入的CD基因片段进行测序,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）Z—CD用脂质体介导转染HEK293,提取细胞蛋白,western blot检测CD基因的表达情况.结果：阳性重组质粒pcDNA3．1／HA—myc-His（-）ZCD经Eco砌和BanHI双酶切后,获得约为5．5kb片段和1．3kb插入片段,序列分析表明插入的片段与GenBank发布的序列一致．western blot检测到CD基因的表达。结论：成功构建了含自杀基因CD的真核表达质粒。     

pMB9 plasmids bearing the Salmonella typhimurium his operon and gnd gene

A plasmid containing the entire Salmonella typhimurium his operon was constructed from plasmid pM89 and an EcoRI fragment of phi 80 his imm lambda DNA. The recombinant pST41 also includes the glucose 6-phosphate dehydrogenase (gnd) gene and has one EcoRI endonuclease cleavage site in the integrated fragment. This plasmid served as a source for the construction of two additional plasmids, one carrying the OGDC-region of the his operon and the other a CBHAFIE segment of the his gene along with the gnd gene. The presence of the his operon in the constructed plasmids was confirmed by hybridization to S. typhimurium his RNA. The location of the gnd gene in the CBHAFIE fragment of the his gene was confirmed genetically: after transfection with the plasmid bearing the gnd gene, a gnd recipient gained the capacity to utilize gluconate as a sole carbon source. The DNAs of the three hybrid plasmids were analyzed by gel electrophoresis. By comparing the EcoRI endonuclease cleavage pattern of these three hybrid plasmids with the DNA cleavage pattern of phi 80 his imm lambda, phi 80 imm lambda and lambda phages, the EcoRI cleavage map of phi 80 his imm lambda was obtained.     

苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)DNA的提纯及多角体蛋白基因片段的克隆

本文报道了从被AcNPV感染的大蜡螟中提纯到AcNPV DNA,以质粒pBR325作为载体,从AcNPV基因组DNA EeoRI片段克隆中得到含AcNPV多角体蛋白基因片段的重组质粒。经原位杂交,酶切鉴定,DNA顺序分析,并与Hooft Van Iddekinge等人测定的结果比较,证明筛选到的7.3kb EcoRI片段包含了AcNPV多角体蛋白结构基因及其启动基因。核多角体病毒多角体蛋白启动基因是迄今为止在真核细胞中所发现的最强启动基因之一,是理想的表达外源基因的启动子。     

懒猴高重复顺序DNA的核苷酸顺序分析及其与类α-DNA顺序的比较

为确知懒猴高重复顺序与灵长类类α顺序间的相互关系,我们将懒猴DNA经EcoRI酶切所得到的高重复顺序DNA的最小片段重组到质粒pUC~(12)上,经转化、筛选、鉴定得到含有懒猴高重复顺序片段的克隆,命名为pLS(EcoR Ⅰ)-1,测定其全部核苷酸顺序为641bp,发现该顺序有与类α顺序的相似性,但变异性较大,我们对此进行了讨论。