确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据I.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．］,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛抱相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据：Ⅰ.中国被毛孢与冬虫夏草之间 …

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢「Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．」,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据* I.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．］,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛抱相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

西藏冬虫夏草无性型的分子生物学研究

从西藏采集的冬虫夏草子实体中分离出 3个菌株C3、C4、C5,通过培养特征的研究以及采用分子生物学方法 ,以rDNAITS区为分子指标 ,与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk .)Sacc.) ]的有性世代及中国被毛孢 (HirsutellasinensisLiu ,Guo,Yu&Zeng)进行比较分析 ,发现C4的培养特征与C3、C5 完全不同 ,其序列与冬虫夏草的相似率为 93 %,与中国被毛孢的相似率为 94%,而C3、C5 与冬虫夏草的相似率很低 (分别为 5 5 %和 6 9%) ,从而证明C4是西藏冬虫夏草的无性型 ,为中国被毛孢。     

被毛孢属一新种—长座虫草的无性型

报道长座虫草Cordyceps longissima Kobayasi的无性型为长座被毛孢新种Hirsutella longissima sp.nov.。用子囊孢子分离得到的无性型与子座柄部粘片所见的被毛孢相同;用分离菌在米饭培养基上人工诱发出的子座与天然子座相似,这表明长座被毛孢为长座虫草的无性型。     

利用原生质体紫外诱变技术选育可常温发酵的中国被毛孢新菌株

中国被毛孢(Hirsutella sinensis)是天然冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.]的真正无性型,其生长温度低(低于20℃),生长缓慢(发酵周期长达20～30d),对人工发酵的技术条件要求很高,因而大大增加了工业化发酵生产的成本和技术难度。为了解决上述问题,实验中从天然冬虫夏草子座中分离到中国被毛孢菌株BS-1,并对其进行了原生质体紫外诱变处理。经过粗筛和精筛,从中选出一株可常温下(25～28℃)发酵、生长迅速(发酵周期4～5 d)、有效成分(甘露醇和腺苷)含量显著高于原始菌株的诱变株BS-5962。通过连续10代PDA斜面继代培养和摇瓶试验,以及连续3批的1t罐的中试试验,检查结果表明所得诱变株性状优异而稳定。可为降低中国被毛孢的液体深层发酵成本和技术难度提供一种有效的解决方案。     

冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定

分离工作在四川康定及北京进行。方法是将康定收集的14批新鲜冬虫夏草,经整体灭菌后,分别割取子座、柄和虫体三部,然后将各部再切割成绿豆大小样的接种体,置于含1％胨的PDA上,在20℃温箱中让其生长;也少量地进行了子囊孢子分离,结果获得90％以上是同一种分生孢子阶段真菌的培养物。而且对该培养物的鉴定表明,是被毛孢属(Hirsutella)一新种——中国被毛孢(Hirsutella sinensis sp.nov.)。并根据这些多批次且大数量接种体(1000个以上)、多途径且重复持续分离,连同子囊孢子分离以及1988年康定点上再次分离的相互验证,皆得到同一种真菌——中国被毛孢这一事实,我们初步结论:中国被毛孢是冬虫夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]的无性阶段。     

一种寄生家蚕被毛孢的鉴定及产孢条件优化

【目的】对寄生家蚕的真菌被毛孢进行鉴定和孢子培养进行研究。【方法】采用形态特征比较和内转录间隔区(ITS)序列构建系统树进行鉴定,通过单因素筛选和正交试验进行产孢条件优化。【结果】根据形态特征比较和系统发育分析,该真菌为鹿儿岛被毛孢Hirsutella satumaensis Aoki。较优产孢条件为(质量体积比):蛋白胨3%,葡萄糖1%,蚕蛹粉1.5%,维生素B1 1%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,琼脂2%,蒸馏水1 000 mL,25°C。【结论】鹿儿岛被毛孢为已知种,文中对其显微特征进行了重新描述并补充相关分子系统学资料;产孢条件的优化可为该类群真菌孢子的获得与应用提供参考。     

西藏冬虫夏草无性型的分子生物学研究*

从西藏采集的冬虫夏草子实体中分离出 3个菌株C₃、C₄、C₅,通过培养特征的研究以及采用分子生物学方法 ,以rDNAITS区为分子指标 ,与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk .)Sacc.) ]的有性世代及中国被毛孢 (HirsutellasinensisLiu ,Guo,Yu&Zeng)进行比较分析 ,发现C4的培养特征与C₃、C₅ 完全不同 ,其序列与冬虫夏草的相似率为     

培养时间相关的中国被毛孢代谢产物初步分析

采用偏最小二乘判别分析法(PLS‐DA)分析不同培养时间中国被毛孢代谢产物的变化。结果表明,在不同培养时间内,供试菌株菌丝的次级代谢产物差异显著。根据代谢组差异可将中国被毛孢培养时间分为前期(19d前)、中期(19–26d)、后期(26d后)3个阶段。3个培养阶段共出现43种显著差异化合物,其中仅在培养前期出现的差异化合物有3种,大部分差异代谢物出现在前期后段及中期,包括8种抗生素及多种具有独特生物活性的物质,在培养后期有3种抗生素没有检测到。在整个培养过程中,有些代谢物可能是受反馈调节机制控制,其含量呈波动变化;有些是持续合成的稳定的代谢终产物,其含量持续增加;有些由于合成速度逐渐减慢,或分解速度逐渐加快而出现含量持续下降。从代谢物的利用角度来说,人工培养菌丝适宜在培养中期采收,因为此阶段生物活性代谢物最多,但对于含量持续下降的化合物的利用应在培养前期采收;对于含量持续增加的化合物的利用宜在培养后期采收。     

人工培养冬虫夏草研究

冬虫夏草 [Cordycepssinensis (Berk .)Sacc .]是名贵中药和珍稀滋补品 ,是由其无性型中国被毛孢 (Hir sutellasinensisX .J .Liu ,Y .L .Guo ,Y .X .Yu&W .Zeng)侵染蝠蛾属 (Hepialusspp .)幼虫形成的菌虫复合体 ,分布在我国青海、西藏、四川、云南和甘肃等地的海拨 35 0 0～ 5 0 0 0m高寒灌丛草甸。自 1980年至今持续进行冬虫夏草的人工培养研究 ,分离获得了冬虫夏草的无性型菌株 ,经鉴定为中国被毛孢新种 ,并对其进行了一系列培养试验 :在培养基上能产生子座 ;低海拔环境下规模化室内饲养寄主昆虫成功 ,人工条件下 1年可完成寄主昆虫一个生活周期 ,且幼虫个体大 ;室内人工培养冬虫夏草取得成功。     

冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化

文献报道从冬虫夏草中分离得到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢,本研究检测了蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌及其DNA在冬虫夏草中的共存,同时检测了2个真菌在冬虫夏草成熟过程中的竞争增殖力。应用色谱法和质谱法检测了冬虫夏草及中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱。在冬虫夏草中检测到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢活菌,在虫体和子座中检测到这两个真菌的DNA。从子座露出地表后,冬虫夏草的成熟伴有蛋白质和小分子有机化合物指纹谱的动态变化,中国被毛孢竞争增殖力下降(P<0.001)。中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱均不能与冬虫夏草的成分完全重叠,与中国被毛孢相比,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的指纹谱更相似。结论:中药冬虫夏草的成熟伴有蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌共存于它的虫体和子座,也伴有冬虫夏草化学成分的变化和中国被毛孢竞争增殖力的下降。     

正交优化冬虫夏草菌种油混悬制剂

利用油混悬剂独有的剂型特性可提高人工培育冬虫夏草中的接种侵染率, 因而研制高活力冬虫夏草菌种油混悬剂可推动其产业化的发展。根据油混悬剂的特殊性, 对MTT法进行改进及优化, 结果为: 反应时间120 min、反应温度37°C、以甲苯为萃取剂, 活细胞量与琥珀酸脱氢酶活力线性相关。依据该方法筛选制剂中助剂的种类及浓度, 并通过正交试验进一步优化, 获得冬虫夏草菌种油混悬剂高活力配方为: 菌种量0.15 g/mL、硬脂酸铝60 mg/mL、司班-80 50 μL/mL。稳定性试验结果表明, 该制剂在4°C下保     

冬虫夏草的研究进展

冬虫夏草是著名的传统中药,具有多种药用功效。综述了近几年国内外冬虫夏草在无性型的确证、液体发酵、活性成分分离分析、药理学等方面的研究进展。     

莲状虫草及其刺束梗孢无性型

报道采自安徽省万佛山自然保护区的一种寄生在蜘蛛上的虫草标本,经鉴定为莲状虫草Cordycepsnelumboides。经多批次利用子囊孢子分离得到其刺束梗孢无性型Akanthomyces,属首次报道,并在人工固体培养基上得到了与野生标本一致的子实体,从丽确证了有性型与元性型之间的对应关系。经研究发现,KOBAYASI和SHIMIZU对莲状虫草次生子囊孢子的原始描述可能有误。     

中国被毛孢分生孢子形成过程显微结构的研究

分生孢子是中国被毛孢(H sinensis)生活史中极为重要的一个环节,其在冬虫夏草侵染和形成过程中有着十分关键的作用.本实验以中国被毛孢纯培养菌种为实验材料,采用显微镜观察了其菌丝体经营养生长产分生孢子过程中显微结构变化,结果表明:中国被毛孢在固体培养条件下,可以形成分生孢子,其形态和产生方式与微循环产孢过程中形成的分生孢子一致,同时,在产孢过程中,还存在瓶梗结构纵裂形成对生分生孢子的现象.     

人工培殖冬虫夏草D-甘露醇的含量测定

采用水提回流离心的方法,提取分离人工培殖冬虫夏草中D-甘露醇,用高碘酸钠与甘露醇反应产生黄色的3,5-二乙酰-1,4-脱氢二甲基吡啶,在波长412 nm处测定其最大吸收.甘露醇浓度在10～50 mg/L之间时,与吸光值(OD412)有良好线性关系,线性方程为C=79.172x-0.0713,相关系数r=0.9999.人工培殖冬虫夏草中D-甘露醇的含量分别为89.64 mg/g(2005年)、91.86 mg/g(2006年)、94.71 mg/g(2007年)、98.98 mg/g(2008年)、97.50 mg/g(2009年)、94.71 mg/g(野生)和96.84 mg/g(野生).人工培殖冬虫夏草与野生冬虫夏草D-甘露醇的含量基本相同.     

中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节作用的比较

目的观察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的影响。方法分别给予中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉后,测定观察对小鼠碳粒廓清功能、迟发性变态反应、溶血素抗体、淋巴细胞增殖和NK细胞活性等的影响。结果3．0g／kg中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉可显著提高小鼠吞噬指数和半数溶血值（P〈0．01）、显著提高T、B淋巴细胞增殖能力（P〈0．01,P〈0．05）、显著提高NK细胞活性（P〈0．05）,0．5～1．5g／kg中国被毛孢都能显著抑制小鼠耳廓肿胀（P〈0．01,P〈0．05）,同时还能抑制脾脏和胸腺增大（P〈0．01,P〈0．05）。结论中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作用,而中国被毛孢免疫抑制及增强天然免疫系统作用要优于蝙蝠蛾拟青霉,而对适应性免疫系统增强作用蝙蝠蛾拟青霉优于中国被毛孢。