利用激光微束穿刺法将外源基因导入小麦的研究

用激光微束穿刺法将携带有新霉素磷酸转移酶（ＮＰＴ－Ⅱ）基因的质粒ｐＪＩＴ１０１导入京花１号小麦幼胚细胞。方法是将小麦幼胚细胞进行高渗缓冲液预处理,用微米级的激光微束处理,然后在卡那霉素培养基上筛选出具抗性的愈伤组织及绿色小植株。第一年,从１５０个小麦幼胚中,在卡那霉素培养基上筛选出４株绿苗,取两株进行ＮＰＴ－Ⅱ酶活性分析,测到了ＮＰＴ－Ⅱ酶的活性。第二年重复实验,从２４５个小麦幼胚中,经筛选获得１株绿苗,进行了叶片ＤＮＡＰＣＲ扩增检测,转化的绿色小苗扩增出所导入的ＮＰＴ－Ⅱ基因编码的片段。结果表明,外源ＮＰＴ－Ⅱ基因已导入了小麦,并实现了整合表达。     

用微弹轰击法将GUS基因导入小麦的完整细胞

微弹轰击法将外源DNA导入小麦(Triticum,aestivum)未成熟胚和悬浮细胞系的完整细胞。用pCI GUS作报告基因,质粒DNA涂于钨粉微弹表层,用基因枪轰击使微弹穿透细胞壁进入小麦细胞。处理2天后,用x—glucuronide染色,对GUS基因产物的活性进行鉴定,GUS基因表达的细胞呈深蓝色的小点。小麦幼胚表面的蓝点最多可达40～50个,悬浮细胞系中GUS基因表达的细胞较少。试验表明微弹轰击法是小麦组织水平上进行外源基因导入的一个有效途径。试验对微弹轰击的有关参数及条件进行了讨论。     

昆虫病毒重组质粒的快速提取

质粒的提取与纯化是基因工程的重要内容。我们用昆虫杆状病毒BsNPV DNA的Bam HI片段与质粒pBR322重组得到重组体pBSa18和pBSb36。用LB摇床培养。 质粒pBR322 DNA用Gonzalls等(1980)的常规法提取。重组质粒的提取是离心40ml培养液收获细胞,加pH7.8 4×TEA缓冲液50ml,GSE(甘油50％,SDS 5％,EDTA0.1M)18ml,70℃保温10分钟,-20℃冷冻过夜,次日在4℃离心12 000r/min15分钟,取上清直接进行制备性琼脂糖凝胶电     

DNA重组技术：Ⅲ.重组质粒在大肠杆菌中的转化

氯化钙法是用质粒DNA转化细菌细胞,尤其是大肠杆菌细胞最常使用的方法。实验操作如下: (1) 将受体菌接种在平板培养基上划线,37℃过夜,进行活化。 (2) 挑选单菌落,接于5ml LB培养液,37℃震荡过夜。 (3) 从上述培养液中取0.5ml,转入50mlLB培养液,37期震荡培养2～4小时,到细菌密度大约为5×10~7/ml,OD_(575)约为0.8。     

成纤维细胞对体外培养的骨胳肌细胞早期发育的影响

用无血清、无胚胎提取液的培养液培养由鸡胚腿肌制成的细胞悬液,在排除神经因素的条件下,研究成纤维细胞对体外培养的骨胳肌细胞早期发育的影响。实验组的培养液由2份培养过成纤维细胞的 Eagle's(MEM)液(条件培养液)和1份 Eagle's 液组成。对照组的培养液为 Eagle's 液。细胞悬液被稀释成7种密度(1×10~6—1×10~4细胞/ml)。所得结果如下;(1)成纤维细胞作为支架,肌母细胞在其上面分裂和融合。成纤维细胞的条件培养液维持肌细胞的存活,并促进其发育;(2)肌母细胞的融合与细胞密度有关。实验组肌母细胞融合所需的最低细胞密度是3×10~4细胞/ml,即30个细胞/mm~2,而对照组为3×10~5细胞/ml,即300个细胞/mm~2。实验结果提示,肌细胞早期发育可不依赖于神经因素,它能被胚眙肌肉中的成纤维细胞所促进。     

小偃麦原生质体培养及植株再生

硬粒小麦(Triticum durum Desf.AABB)和中间偃麦革[Elytrigia intermedium(Host)Nevski BBEEFF]的杂种 F_1——小偃麦的幼穗诱导的胚性愈伤组织继代培养近两年后,转入修改的 MS 液体培养基建成胚性细胞悬浮系。从此悬浮系分离的原生质体在修改的 KM_(8p)培养基中培养48小时后出现第一次分裂。15天后,在液体浅层培养条件下的细胞分裂频率为2%;而用1.2%琼脂糖固化进行固体平板培养时,细胞的分裂频率则为12.14%。20—30天后,添加渗透压降低的原生质体培养液。当从原生质体再生的愈伤组织长至2—4mm 大小时,逐步转至生长及分化培养基上再生出完整植株。     

小麦×玉米单倍体植株再生体系的建立

为获得一定规模的小麦单倍体植株以构建小麦DH(Double Haploid)群体,采用小麦(Triticum aestivum,2n=42)与玉米(Zeamays,2n=20)远缘杂交诱导小麦单倍体胚,经胚拯救产生单倍体植株,研究了1/2MS培养基中幼胚取材时期、幼胚大小、4℃处理时间、暗处理时间对单倍体胚培养再生成苗的影响,结果表明:授粉后12天~16天取材的幼胚经胚拯救后成苗率无明显差异;0.5mm~1.0mm大小的幼胚成苗率显著高于0mm~0.5mm和1.0mm~1.5mm大小的幼胚成苗率;1天~3天短期4℃处理对胚萌发具有一定促进作用,但处理3天后,出愈率和成苗率降低;胚培养过程中12天左右的24h暗处理能有效提高成苗率。     

Wistar-lmamichi大鼠早期胚的体外培养

有关资料指出,大鼠胚胎的体外培养同小鼠一样具有“2-细胞阻断”的问题,4-细胞期胚的培养也未见成功的报道。本文以F_(12)培养液和PBS缓冲液为基本培养基,添加胎犊血清(FCS)或大鼠血清(RS),观察Wistar-lmamichi大鼠早期胚的体外发育情况。 实验方法是将以PMSGHCG诱导超排处理方法采得的1-细胞期胚,2-细胞期胚,4-细胞期胚和8-细胞期胚,用灭菌处理过的培养液冲洗两次后,移入液体石蜡覆盖下的微小滴内,然后置于温度为37℃,     

用微载体悬浮培养大量生产高活性鼠干扰素

用自制的MC-1型微载体进行悬浮培养,当其浓度为5mg/ml时,可较好地用以培养和增殖鼠L929细胞。当接种细胞量为30×10~4/ml左右时,一般在3天即可增殖至1×10~6细胞/ml。用25IU/ml鼠IFN起动12—24小时,用NDV作诱生剂,并采用环己亚胺(20μg/ml)和放线菌素D(2μg/ml)进行超诱导,IFN产量可高达1×10~6IU/ml左右,比活接近1.3×10~5IU/ml蛋白。尽量去除培养基,加胰酶—柠檬酸盐消化和高速搅拌,使细胞从载体上分离,再加新鲜培养基和微载体的方法进行扩大生产看来是可行的。这些实验表明采用微载体悬浮培养细胞的技术将更适于IFN的工业化生产。     

利用微束激光穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究初报

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pB IBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株。研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等。研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难。     

普通小麦与球茎大麦杂交后受精及胚胎发育的细胞形态学研究

普通小麦(2n=6x=42)品种及其杂种F_1为母本与四倍体球茎大麦(2n=4x=28)杂交,发现属间杂交的受精过程和胚胎生长发育比小麦自交时缓慢。球茎大麦花粉给小表授粉后4小时精子进入卵接触卵核,6小时初生胚乳核开始形成。杂合子第一次有丝分裂和授粉后22小时胚乳核的分裂中出现染色体落后及微核,授粉后9天胚乳核出现解体现象,10天后幼胚局部细胞也出现解体。13天后胚囊成为空腔,已观察不到细胞轮廓。在北京田间于授粉后9—10日即须将幼胚离体培养。     

水稻幼胚愈伤组织再生植株

植物名称:粳稻(Oryza sativa subsp.Japo-nica)“双丰一号”品种。材料类别:开花后7—9天正在胚器宫原基分化期的幼胚。培养条件:取开花后7—9天的水稻子房用0.2％HgC1_2灭菌15分钟后,将正在分化期的未成熟幼胚挑出放入诱导培养基上,诱导愈伤组织的培养基用N_6无机盐,其它附加物如下(单位mg/1):2,4-D2.0,甘氨酸2.0,B_1.0,B_60.5,烟酸0.5,蔗糖5％,琼脂1％,灭菌前调至pH5.8。在25±2℃黑暗下培养17—20天后,将愈伤组织转移到MS分化培养基上,每升中加6-BA1毫克及2,4-D 0.1毫克,蔗糖3％,每日光照12小时,光强为5000—6000 1x,温度25±     

培养基中CuSO4和Fe盐对小麦胚培养再生效果的影响

Fe和Cu是植物组织培养中不可缺少的成分,作为金属离子螯合剂与植物生长发育中一些关键酶的活性密切相关。优化培养基中Fe和Cu离子的浓度可提高组织培养再生效率,对建立小麦高效遗传转化体系有一定意义。本研究以小麦基因型CB037、新春9号和Bobwhite为材料进行成熟胚和幼胚培养,研究了CuSO4和Fe2-EDTA对小麦组织培养再生效果的影响。结果发现,培养基中添加0.1～4.1 祄ol L-1 CuSO4对小麦成熟胚组织培养无显著效果,超过6.1 祄ol L-1对愈伤组织有毒害作用;培养基中添加40 祄ol L-1 Fe盐对小麦成熟胚组织培养和植株再生具有促进作用;不同小麦基因型其幼胚培养对Fe盐的反应不同,40 祄ol L-1～50 祄ol L-1 Fe盐处理对CB037幼胚再生效果最好,20 祄ol L-1 Fe盐浓度对新春9号和Bobwhite幼胚再生效果好,高浓度铁盐抑制作用显著;在相同培养条件下,CB037幼胚再生率最高,新春9号次之,Bobwhite最低。     

人工合成冬性六倍体小麦的研究

以冬性四倍体硬粒小麦(Triticum durum,2n=28,AABB)为母本与粗山羊草(Aegilops tauschii,2n=14,DD)杂交,得到的单倍体幼胚(n=21,ABD)经组织培养拯救,获得的幼苗经染色体加倍而成为合成小麦(AABBDD)。从中鉴定、筛选出冬性的合成小麦。幼胚仅在1/2 MS培养基上培养,成苗率为75.81%;根据幼胚的发育状态,将发育较完善的幼胚直接接种在1/2 MS培养基上,将发育不良的幼胚先接种于1/2 MS+2 mg/L 2,4-D培养基上进一步养育幼胚,之后视幼胚发育状况再将其转入1/2 MS培养基中培养成苗,此方法的成苗率为92.44%,较前者的成苗率提高了16.63%。染色体加倍在冬季塑膜拱棚内用0.05%秋水仙素进行半根法处理,较容易获得健壮苗,并且分蘖多。     

节节麦与小麦、黑麦或小黑麦的杂种幼胚的离体培养

以山羊草属节节麦作母本,普通小麦、二粒系小麦、黑麦及小黑麦分别作父本杂交,将授粉后不同天数的幼胚取下,在无菌条件下接种于试管内培养。共接种101个杂交组合的1090个幼胚,分化成全苗的31个(2.84％),无根小苗20个(1.83％),类苗24个(2.2％)、愈伤组织66块(6.05％)未分化的950个(87.16％)。在31个全苗中包括普通小麦的21株、二粒系小麦的5株、黑麦的2株、小黑麦的3株。试验说明,用二倍体节节麦作母本,借助于幼胚培养,也可以获得远缘杂种。     

用微载体悬浮培养系统增殖细胞和病毒

我们用我院制备的MC-1型微载体成功地培养了BHK-13,BHK-21,和CHO-KI三株细胞。当微载体浓度为5mg/ml,细胞接种量为30×10~4细胞/ml左右时,一般在三天都可达到1×10~6细胞/ml。此时接种10~(-1)或10~(-2)的VSV,在37℃培养20-24小时,病毒产量可达到6LogTCTD_(50)/ml以上,其中以CHO-KI细胞的产量最高,它们与静止培养的细胞产量基本一致,也不亚于鸡胚细胞增殖的产量。目前用该系统增殖的VSV已用于IFN的研究工作中。实验的结果也表明,用该系统增殖其它病毒和制备疫苗,以及大量培养已引入重组IFN基因的CHO工程细胞也将是可行的。     

大麦和小麦杂种胚的离体培养及杂种幼苗的形态和染色体观察

用矮六稜裸大麦天津1号与多种小麦品种进行正、反交。授粉后在柱头上滴赤霉酸,刺激幼胚生长,并结合离体培养技术培养杂种幼胚。在几个组合里获得大麦与小麦属间杂种。对杂种幼苗的形态和根尖细胞染色体进行了观察,并且报告了调整培养基中激动素浓度后的效果。     

环形电极介导的小麦基因转化

用环形电极电激法有效地将外源DNA导入完整的小麦幼胚组织中。电激的物理参数采用770V／cm场强、800μF电容、100μg／mL质粒DNA(含有bar和GUS双标记基因),幼胚被电激3次。经PCR和Southern杂交分析表明,外源基因已稳定整合到小麦基因组中,转化频率为7．5％,高于相同处理条件下基因枪法的转化频率(4．2％)。     

八倍体小滨麦的形成及细胞遗传学研究

通过普通小麦(AABBDD 2n=42)与滨麦(JJNN 2n=28)杂种幼胚培养,获得F_17株(ABDJN 2n=35)。用秋水仙碱处理分蘖节后,再用普通小麦回交得到11粒种子。幼胚培养后得到BC_1F_17株(AABBDDJN 2n=56)。经过连续自交选育至BC_1F_0代,获得3种穗型的八倍体小滨麦(AABBDDJJ或AABBDDNN)。根尖细胞染色体数目为52—56。花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ,2n=28Ⅱ的细胞占45.38—48.89%,染色体构型为1.69Ⅰ+27.07Ⅱ+0.06Ⅲ。株高89—105厘米;穗长13—16厘米;小花数96—108个;籽粒红色、大粒、不饱满,千粒重44.5—51克;自交和天然结实率分别为27.70—54.58%,49.48—58.63%;成熟期偏晚;耐寒耐旱;抗条锈、秆锈、叶锈、赤霉和白粉病。     

微束激光照射黑眶蟾蜍早期胚胎产生骈联胚的研究

用红宝石激光微束照射黑眶蟾蜍卵二细胞期的卵裂沟,具有产生双头或双头双尾的骈联胚。本文对获得的三只骈联胚进行研究。