甲氨蝶呤对早期神经胚基因表达的影响

目的:利用甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)干预孕鼠,探讨MTX对早期神经胚基因表达的影响。方法:用MTX(4.5 mg/kg体重)干预孕鼠,通过NimbleGene表达谱芯片、Real time-PCR及免疫组化等方法进行差异表达基因的筛选和验证。结果:MTX处理后神经管畸形(NTDs)发生率为32.1%。表达谱芯片筛选出166个差异表达基因,其中4个凋亡相关基因(Endog,Trp53,Casp3,Bax)均表现为上调(fold change1.5,P0.05),3个增殖相关基因(Ptch1,Pla2g4a,Foxg1)均表现为下调(fold change0.67,P0.05);NTDs胚胎神经上皮Caspase-3表达显著升高(P0.05),phospho-histone H3(pH3)表达显著降低(P0.05)。结论:MTX影响了早期神经胚的基因表达,尤其是引起了凋亡、增殖相关基因表达的异常,这可能在叶酸缺乏引起NTDs发生的相关机制之一。     

mbr-FPGS高效表达质粒增强Jurkat细胞对甲氨蝶呤的敏感性

叶酰多聚谷氨酸盐合成酶(Folylpolyglutamate synthetase,FPGS)是将化疗药物甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)转化成甲氨蝶呤多聚谷氨酸盐(MTXPG)的关键酶,其表达水平直接影响肿瘤细胞对MTX敏感性。与B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)相比,T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中FPGS表达水平低,因此对MTX不敏感。本实验室前期研究证实,位于BCL2基因3′-UTR区的一段长279 bp的DNA序列mbr具有显著的增强子效应。文章构建了含有mbr增强子样序列的FPGS表达质粒,用其转染Jurkat细胞后,分别以Westernblotting和MTT法检测FPGS表达水平及MTX对肿瘤细胞的抑制率。结果表明mbr能够显著提高FPGS表达质粒的表达水平,并有效增强Jurkat细胞对MTX的敏感性。这一结果为将基础研究结果应用于临床、提高MTX对T-ALL细胞的化疗疗效提供了新的思路。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中的高效表达

构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr~-)。用氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10~(-7)mol/L MTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/10~6细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。     

adw与adr亚型乙型肝炎表面抗原基因在哺乳动物细胞中的表达

以pSV2-dhfr DNA为载体,在其单一酶切点Bg1Ⅱ处分别插入adw或adr亚型的HBVDNA Bg1 ⅡA片段(包括完整的pre-s及s基因),构成PSDHB_(r-1)和PSDHBw重组质粒。将其分别与pX1 DNA用磷酸钙沉淀法共转化LTK-细胞,在HAT培基选择压力下,挑选LTK~ 细胞,这些细胞均能有效表达HBsAg。再改用MTX选择培基,并逐渐增加其药量,从MTX抗性细胞中获得稳定表达HBsAg的Mwc-1和Mrm细胞系。     

红细胞生成素cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

将(?)红细胞生成素(EPO)cDNA构建的重组表达质粒用电穿孔法引入COS-7细胞,ELISA和红系集落测活结果表明,该重组质粒在哺乳动物细胞中能够表达有生物活性的红细胞生成素。进一步将其转染CHO-dhfr~-细胞,经氨甲喋呤(MTX)加压扩增,混合细胞中各克隆表达水平比较一致,细胞的平均表达水平为2-3μg/10~6 Cells/24hr。细胞冻存后复苏其表达水平与冻存前一致,表明外源基因整合稳定。     

人EPO高效表达细胞株的筛选与鉴定

用氨甲喋呤 (MTX)对稳定转染人促红细胞生成素 (EPO)基因的CHOˉ(DHFR缺陷型 )细胞株进行梯度加压 ,并使用α -MEM培养基进行培养 ,使DHFR基因在CHOˉ细胞中大量扩增 ,从而使EPO的表达量提高。经检测分析EPO的表达量 ,筛选出EPO高效表达的细胞株。结果表明 ,用MTX加压到 16× 10 - 7mol l和 6 4× 10 - 7mol l浓度时 ,收集的细胞培养液经 (NH4 ) 2 SO4 盐析、透析等处理得到EPO抽提液 ,经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测出与标准品相对应的一条带 ,WesternBlot证明该带确为EPO。     

基因与MTX副作用的相关性的新进展

抗叶酸刺MTX被运用于急性成淋巴细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤,骨肉瘤,银屑病,类风湿性关节炎等疾病的治疗当中,但在临床上给病人相同剂量的MTX时,病人的反应及毒性的种类也大为不同.这多样性从一定程度上来说和基因的连续变更有关,本文章主要从亚甲基四氢叶酸还原西每(MTHFR)基因,MTX跨膜运输中的两种流出载体基因和MTX新陈代谢相关的四种基因中的单核苷酸多态性(SNP)两方面来阐述MTX在不同病人中出现的不良反应的新进展.     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI在CHO细胞中的高效表达

为了得到t—PA组合突变体FrGGI在CHO细胞中的高效表达,将表达质粒筛选基因启动子上游的增强子(enhancer)去除．构建了FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。酶切线性化后．采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr^-)。氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞,混合加压．挑选克隆。在1×10^-7mol／L MTX压力下。获得表达水平达1 500～2500Iu/106细胞·24h的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好．倍增时间约为36h．且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。     

介导多药耐药的ABC转运蛋白超家族与MTX耐药性的关系研究

细胞耐药性的产生是导致肿瘤化疗失败的重要因素, 尤其是多药耐药是目前研究的一个重点。ABC转运蛋白超家族成员介导药物的外排, 与多药耐药密切相关。为了解该家族成员与MTX耐药的相关性, 进一步探讨MTX的耐药机制, 应用SuperArray基因芯片对MTX耐药前后编码ABC转运蛋白超家族成员的mdr1、mrp1、mrp2、mrp3、mrp5、mrp6和abcg2 7个基因进行检测, 并对MRP1和MRP5蛋白表达进行了验证。结果显示, 与MTX耐药性相关的ABC转运蛋白超家族成员主要为多药耐药相关蛋白, 其中mrp1和mrp5呈现高表达, 并且, 在MTX抗性细胞中, MRP5在mRNA及蛋白水平的表达均明显增强, 提示其在MTX耐药机制中起重要作用, 可能为潜在的药物作用靶点。     

重组羧肽酶G2的原核表达、纯化及活性分析

在原核表达系统中实现羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2,CPG2)的表达,并对CPG2进行了纯化和活性测定。通过PCR扩增得到编码CPG2的基因片段,利用基因重组技术构建原核表达质粒p ET-30a-CPG2,在Escherichia coli中进行诱导表达,菌体经超声破碎后利用金属螯合亲和柱和阴离子交换层析柱对目标蛋白进行纯化。目的蛋白能够以可溶形式表达,SDS-PAGE和Western blotting检测有特异的蛋白表达条带。纯化的CPG2有降解氨甲喋吟(MTX)活性,酶活力达到400 U/mg。     

利用同源蛋白的信号肽和前肽序列在CHO细胞中表达重组人BMP6

BMP6属于TGF-β超家族,具有较强的骨诱导作用。主要利用BMP6自身的信号肽、前肽与成熟肽基因序列构建了表达质粒pcDNA-BMP6;同时利用BMP2的信号肽、前肽与BMP6的成熟肽基因序列构建了表达质粒pcDNA-BMP2/6。将两种质粒分别瞬时转染Cos7细胞,发现质粒pcDNA-BMP2/6表达rhBMP6的效率高于质粒pcDNA-BMP6。然后将质粒pcDNA-BMP2/6与含二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的表达质粒共转染dhfr缺陷型的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞,经G418筛选、氨甲蝶呤(MTX)介导目的基因扩增、亚克隆后得到表达rhBMP6成熟肽的单克隆细胞株。将表达产物rhBMP6初步纯化后,能诱导前成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向转化,显示其具有骨诱导作用。     

proUK-KGDW融合基因在CHO细胞中的高表达

利用常规分子生物学技术,构建了新型高效的proUK-KGDW融合基因的分泌型哺乳动物细胞表达载体。将该载体线性化后转染CHO/dhfr-细胞,经G418筛选获得阳性克隆,然后挑取表达水平较高的克隆进行MTX加压扩增,以提高proUK-KGDW杂合体的表达水平,经2～3轮MTX加压扩增,获得多株表达水平超过10μg/(106细胞·24h)的稳定的高表达细胞株,为proUK-KGDW杂合体的制备及功能研究奠定了基础。     

昆虫抗药性中的酯酶基因扩增研究进展

<正> 基因扩增是基因组数量上呈现的不固定性,是通过改变基因组中某些基因的数量而使其产物增加的过程。 自Alt等发现哺乳动物培养细胞对药物氨甲蝶呤(methotrexate,MTX)产生抗性是由于二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)基因扩增所致以后,在各种动物的抗     

tPA突变体在哺乳动物细胞中的表达

利用携带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的pCI载体,实现tPA突变体(FrGGI)在CHO-dhfr^-细胞中的高效表达,获得高表达细胞株。采用分子克隆常规技术,将去除3’端非蛋白编码区的tPA突变体cDNA与pCI载体连接,构建真核表达载体pCI—tPA;采用阳离子脂质体转染法转染CHO-dhfr^-胞。经酶切及测序鉴定,证明所构建的质粒正确,转染CHO—dhfr细胞后,经过MTX加压筛选,得到了10株表达水平较高的细胞株,其活性可达每106细胞4000U／24h。以上结果为进行tPA突变体工程细胞株的筛选奠定了基础。     

动物细胞双顺反子高效稳定表达系统建立

建立稳定高效的动物细胞表达系统对于许多重组蛋白质药物的工业化生产有着十分重大的意义。用PCR扩增得到dhfr基因 ,克隆入载体pIRESneo3基因以替换原有的neo^r 基因 ,并将hbFGF作为报告基因插入其多克隆位点 ,得到重组子pIRESdhfr hbFGF ,转导CHO细胞后 ,MTX浓度梯度筛选稳定表达hbFGF的细胞株 ,ELISA与WesternBlot检测培养基中hbFGF的分泌表达。结果发现10、100、1000nmol LMTX组均检测到hbFGF的表达 ,其中表达量最高的一株细胞传代20次后表达量仍能维持较高的水平。因此利用双顺反子表达系统可以实现外源基因在动物细胞中的高效稳定表达 。     

抗人P185~(erbB2)嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达及其活性分析

为降低人抗鼠抗体 (HAMA)反应并在CHO细胞中高效表达抗人P185 erbB2 人 /鼠嵌合抗体 ,将抗人P185 erbB2 单抗C2 5的轻、重链可变区基因分别克隆入具有人抗体恒定区基因组序列和弱化启动子驱动的选择标志基因的真核表达载体中 ,共转染CHO dhfr-细胞 ,经G418及氨甲喋呤 (MTX)梯度加压筛选进行了嵌合抗体的高效表达。采用RT PCR、ELISA、细胞ELISA、免疫荧光细胞化学等实验证实了所表达的抗人P185 erbB2 嵌合抗体的人源性及抗原特异性。培养上清中的抗体产量可达 10 0mg/L ,所表达的嵌合抗体具有抑制P185 erbB2 高表达肿瘤细胞增殖的作用     

超临界流体强制分散悬浮液技术制备的MTX-Fe_3O_4-PLLA-PEG-PLLA复合微球的体外及体内抑瘤活性评价

采用超临界流体强制分散悬浮液技术,通过共沉淀法(C)和包埋法(M)成功制备了负载甲氨蝶呤(MTX)的Fe3O4-PLLA-PEG-PLLA磁性复合微球(MMCMs(C/M)),并从细胞、分子和整体水平对其体外及体内抑瘤活性进行评价.在细胞水平,MMCMs(M)比MTX具有更好的抗增殖活性,而且引起细胞形态学改变趋于凋亡.在分子水平,与10μg/mL MMCMs(C)相比,10μg/mL MMCMs(M)可导致Bax/Bcl-2和caspase-3的mRNA相对表达量显著增高(P0.01);Western blot考察MG-63细胞的pro-caspase-3蛋白表达情况,结果显示,MMCMs(M)组可以有效地活化pro-caspase-3蛋白.在整体水平,构建S-180荷瘤小鼠作为动物模型,体内抑瘤实验结果表明,MMCMs(M)磁诱导组相对于MTX组具有较高的抑瘤活性和低毒性.药代动力学研究表明,MMCMs(M)磁诱导组MTX可以有效地积聚在肿瘤部位.综合实验结果表明,MMCMs(M)可在化学治疗药物磁靶向治疗领域发挥积极的作用.     

应用差异PCR技术研究MTX耐药细胞的遗传学改变

基因扩增是介导细胞产生耐药性的一种普遍性机制。为探讨MTX耐药的小鼠细胞中与耐药机制形成有关的分子遗传学背景,应用差异PCR技术,检测了MTX耐药细胞中DHFR基因的扩增和过表达,并对c-myc及p53基因状态与dhfr扩增之间的相关性进行了探讨。结果表明：dhfr的扩增和过表达直接介导细胞耐药。未检测到c-myc的扩增和p53拷贝数的变化;也未检测到c-myc mRNA水平的改变,但p53基因的mRNA水平明显升高,显示p53可正常表达。这些结果表明dhfr的扩增与这两个侯选基因的状态无关,提示该耐药细胞中可能存在其他的分子遗传学改变允许基因大量扩增。     

中国仓鼠卵巢细胞表达新技术

中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）是基因工程药物生产的最佳表达系统之一,在生物制药中被广泛应用。传统的获得高表达CHO细胞株的方法费时、费力。近年来出现了一些CHO细胞高效表达新技术,它们从克服位置效应,提高基因转录效率、mRNA翻译效率及稳定性、筛选高表达细胞的效率等不同层次调控外源基因在CHO细胞中的高效表达。与MTX加压扩增基因获得高效表达外源基因的方法比较,能够节约时间、减少工作量,不易丢失高表达细胞株。