重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab(rh Fab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸, 使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附, 可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化. 采用自制金属(铜、锌金属离子)螯合层析介质, 以pH和咪唑两种洗脱方法,对rh Fab段的纯化效果进行了探讨. 结果显示: 铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rh Fab的亲和能力更强; pH洗脱方法的重复性优于咪唑法; 金属铜离子螯合层析法对rh Fab进行一步纯化可得到纯度大于95%的rh Fab产品.     

人-鼠嵌合Fab片段的温度诱导表达

构建了具有λＰＲＰＬ启动子高效表达人鼠嵌合Ｆａｂ片段的温度诱导表达型载体ｐＨＺ０１,并在大肠杆功中表达了三种嵌合Ｆａｂ片段：抗前列腺特异抗原（ＰＳＡ）的嵌合Ｆａｂ,抗溶菌酶（ＨＥＬ）的嵌合Ｆａｂ和抗破伤风类毒素（ＴＴ）的嵌合Ｆａｂ,三种表达的可溶性嵌合Ｆａｂ都具有特异结合抗原的能力,嵌合Ｆａｂ的ＣＨ１和ＣＫ区均为人源的,较之鼠源Ｆａｂ具有更好的应用前景。     

小鼠抗天花粉蛋白IgE型单抗的酶解及其Fab的制备

研究了Ｐａｐａｉｎ及Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解小鼠抗天花粉蛋白ＩｇＥ单抗的条件及Ｆａｂ的制备。Ｐａｐａｉｎ和Ｔｒｙｐｓｉｎ两者都可产生Ｆ（ａｂ′）_２,分子量在１５０～１６０ｋＤ左右;经Ｐａｐａｉｎ裂解的主要产物中还有Ｆａｂ,分子量７２ｋＤ,可通过凝胶过滤获得纯的Ｆａｂ。而Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解物经ＤＴＴ还原、碘乙酰胺烷化虽然也可得到Ｆａｂ′（ｔ）,但不易纯化;可见,要制备Ｆａｂ以采用Ｐａｐａｉｎ裂解为好,而制备Ｆ（ａｂ′）_２则可采用Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解。这二个酶的裂解速度是Ｔｒｙｐｓｉｎ大于Ｐａｐａｉｎ。     

小鼠抗天花粉蛋白IgE型单抗的酶解及其Fab的制备

研究了ｐａｐａｉｎ及Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解小鼠抗天花粉蛋白ＩｇＥ单抗的条件及Ｆａｂ的制备，Ｐａｐａｉｎ和Ｔｒｙｐｓｉｎ两者都可产生Ｆ（ａｂ’）２分子量在１５０￣１６０ｋＤ左右；经Ｐａｐａｉｎ裂解的主要产物中还有Ｆａｂ，分子量７２ｋＤ，可通过凝胶过滤获得纯的Ｆａｂ，而Ｔｒｙｐｓｉｎ裂解物经ＤＴＴ还原、碘乙酰胺烷化虽然也可得到Ｆａｂ’（ｔ），但不易纯化，可见，要制备Ｆａｂ以采用ｐａｐａｉｎ裂解为好，而制备     

通过构建轻链二级库对人源抗TNF-α抗体进行亲和力成熟

通过构建轻链二级库的方法,对人源抗ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ进行轻链置换,并筛选出具有更高亲和力的人源抗ＴＮＦ－α单抗的Ｆａｂ。首先用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增正常人全套抗体轻链基因,并与已获得的人源抗ＴＮＦ－α单抗的重链基因配对,构建人源抗ＴＮＦ－α噬菌体抗体轻链二级库,然后筛选与ＴＮＦ－α具有更高亲和力的克隆,经过三轮的生物淘筛（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）,获得了比原来的人源抗ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ具有更高亲和     

人源中和性抗汉滩病毒单克隆抗体Fab段基因的获得和表达

运用噬菌体表面表达技术,获得人源和中性抗滩滩病毒汉滩型Ｇ１基因工程单克隆抗体Ｆａｂ段基因及其表达,并同时获得抗汉滩病毒核蛋白的Ｆａｂ抗体。从能综合征出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中,提取了部细胞ＲＮＡ。通过ＲＴ－ＰＣＲ方法,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ基因特异性引物,从合成了ｃＤＮＡ中经ＰＣＲ扩增了一组轻链和重链Ｆａｂ段基因,将轻链和重链先后插入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３,ｄｎａｌｆ ｖｆ     

金属螯合肽分离纯化及其抗氧化活性的研究进展

综述了金属螯合肽的来源、分离纯化及构效关系,分析了金属螯合肽抗氧化活性的相关研究进展,并展望了金属螯合肽的发展前景。     

片段抗体纯化工艺的优化

以单克隆抗体为特异性载体标记放射性核素用于肿瘤病人的导向治疗 ,已取得很好的效果。用蛋白酶水解全抗体得到的Ｆ(ａｂ′) 2 片段 ,由于去除了Ｆｃ段 ,减小了人抗鼠异种蛋白排斥反应 ,具有分子量小 ,到达肿瘤部位迅速 ,血液本底和非瘤组织的清除快等优点 ,较之全抗体有更大应用潜力。但Ｆ(ａｂ′) 2片段性质不稳定 ,制备工艺复杂 ,采用旧的纯化工艺如分子筛、离子交换、亲和色谱[1～ 3] 等很难制备出符合临床应用质量标准的片段抗体。为此 ,我们在ＦＰＬＣ上建立了疏水作用色谱法纯化Ｆ(ａｂ′) 2 片段 ,取得了理想的结果。本文报道三组不…     

固定化金属螯合亲和膜纯化重组抗菌肽研究

用自行制备的固定化金属螯合亲和膜对N端含六个组氨酸标记的重组抗菌肽进行了分离纯化,并较好地解决了金属离子泄露问题.实验表明,固定化金属螯合亲和膜性能优于传统琼脂糖凝胶介质,完全适用于分离纯化含有多组氨酸标记的重组蛋白质.     

尿素对钼铁蛋白的活性和金属原子簇稳定性的影响

当尿素浓度高于０．５ ｍ ｏＬ／Ｌ时,棕色固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）固氮酶钼铁蛋白的乙炔还原活性呈指数下降;而经厌氧缓冲系统稀释并保温后,又可得到明显恢复。尿素对邻菲口罗啉从还原的或部分缺失Ｐ－ｃｌｕｓｔｅｒ 的ＭｏＦｅ 蛋白中螯合金属原子簇的Ｆｅ 原子均有较大的促进作用。还原ＭｏＦｅ 蛋白在尿素梯度凝胶电泳中的迁移率：在０～１．５ ｍ ｏｌ／Ｌ内,无明显变化;在１．５～５．０ ｍ ｏｌ／Ｌ内,线性变小;在５．０～８．０ ｍ ｏｌ／Ｌ内,则呈平缓状态。结果表明：（１）尿素对不同状态的ＭｏＦｅ 蛋白金属原子簇的影响程度不尽相同,而对蛋白质的变构作用是尿素影响ＭｏＦｅ 蛋白的活性和金属原子簇稳定性的主要原因;（２）ＭｏＦｅ 蛋白的构象与金属原子簇密切相关;（３）ＭｏＦｅ 蛋白在变性过程中,活性下降可能先于分子整体构象的变化     

金属硫蛋白和植物螯合肽在植物重金属耐性中的作用

植物螯合肽和金属硫蛋白广泛存在于植物界中,它们对植物耐重金属特别重要,能够与重金属形成复合物,以缓解重金属对植物的危害。本文就这两种金属螯合蛋白的结构、生物合成和基因调控,以及在植物体内缓解重金属毒害的作用方面作了简要介绍。     

抗HIV-1 gp160独特型阳性抗体的序列分析及表达

为了确定从噬菌体抗体文库中筛选出的抗体的属性和方便目的基因的表达及其产物的纯化,对两株具有“１Ｆ７”独特型的抗ＨＩＶ－１ｇｐ１６０抗体基因进行了序列分析并构建了可溶性表达载体．发现３Ｂ株含有完整的Ｆａｂ段,１Ｄ株只有重链Ｆｄ段．序列测定表明两株克隆的Ｆｄ段基因完全相同,其可变区ＶＨ属于ＶＨⅠ亚群,而３Ｂ株的“轻链”序列与已知的人的κ和λ轻链无同源性．用从另外的Ｆａｂ抗体文库中筛选出来的３株抗乙肝表面抗原抗体的轻链与３Ｂ的重链重组,并选择一个ＨＩＶ－１ｇｐ１６０特异性较好的重组抗体株,命名为３Ｂｓ．构建了１Ｄ株与３Ｂｓ株的可溶性表达载体,免疫印迹实验证实了具有“１Ｆ７”独特型的抗ｇｐ１６０独特型阳性抗体的表达．     

胶质细胞衍生的神经营养因子成熟肽基因的克隆、表达及纯化的研究

通过ＰＣＲ的方法克隆了胶质细胞衍生的神经营养因子（ｇｌｉａｃｅｌ－ｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕ－ｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ）成熟肽的基因,并将其连接到Ｅ．ｃｏｌｉ高效表达载体ｐＥＴ１６ｂ,在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效表达．表达蛋白占菌体总蛋白２１％以上,以包涵体形式存在,经体外复性后用金属螯合亲和层析的方法得到具有较高纯度和活性ｒｈＧＤＮＦ．     

姜老师信箱

<正>蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是您"蛋白质分离纯化技术专题研讨班"的学员,听过您的讲座,受益匪浅,现在想向您咨询一些问题。我有200ml蛋白质样品,想采用羟基磷灰石层析纯化,但是样品溶液中含有1mmol/L的EDTA,请问有什么方法能够有效的去除EDTA,并且蛋白损失少?另外羟基磷灰石层析介质上螯合了少量EDTA,采用什么方法能够去     

从混合的噬菌体抗体库中直接筛选高亲和性的抗肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体

采用噬菌体抗体库技术,从未经免疫的混合人噬菌体抗体库直接筛选抗ＴＮＦα的人源单克隆抗体,３种不同的检测手段表明,经过５轮的筛选,能够与ＴＮＦα结合的噬菌体抗体得到了有效的富集。对所获得的噬菌体抗体克隆进行的初步鉴定表明,７个噬菌体抗体克隆能有效地与人重组ＴＮＦα结合,并且这种结合具有特异性,由这７个噬菌体抗体克隆制备的抗体Ｆａｂ片段也能有效地与ＴＮＦα结合。由此,我们通过噬菌体抗体技术直接获得了ＴＮＦα的人源单克隆抗体,这为进一步制备具有临床应用前景的人源抗ＴＮＦα单克隆抗体打下了基础。     

金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究

金属螯合亲和层析是近20年发展起来的一项新型分离技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文从单组分蛋白质入手,考查了pH值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响,并进行了分析。还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究,比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别,为实际体系的分离研究打下了基础。     

钙、铝金属元素螯合对燕麦多肽DPP4抑制活性的影响

目的：研究多肽LQAFEPLR（LQ8）和EFLLAGNNK（EF9）与金属元素螯合后,多肽金属螯合物的活性及水解后结构的变化。方法：测定多肽LQ8和EF9与钙和铝分别螯合后,对二肽基肽酶IV（DPP4）抑制活性,并将多肽进行体外模拟水解,测定体外模拟水解产物对DPP4的抑制活性的变化,测定多肽螯合金属元素前后和水解前后的傅里叶红外光谱。结果：多肽LQ8和EF9分别螯合钙和铝后,EF9-Ca和EF9-Al对DPP4的抑制活性升高,LQ8-Ca和EF9-Ca在的红外光谱在酰胺I带发生红移;LQ8和EF9的水解产物LQ8-H和EF9-H对DPP4的活性显著下降,水解产物的红外光谱发生了变化,而多肽金属螯合物的DPP4抑制活性基本不会随着水解而发生变化,且其红外光谱图基本保持不变。结论：合成多肽LQ8和EF9的金属螯合物可抑制多肽发生水解,保持多肽的活性。     

噬菌体抗体文库的构建及人源抗HIV-1 gp 160抗体的筛选

构建人源噬菌体抗体文库如下：ＨＩＶ感染者脾细胞中提取ｍＲＮＡ,经反转录再以人ＩｇＧ重链Ｆｄ两端及轻链“通用”引物分别扩增Ｆａｂ基因片段,依次插入到噬菌粒载体ｐＣｏｍｂ３中,电转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经辅助噬菌体救助,重组噬菌体得以溶源裂解,Ｆａｂ表达于噬菌体包膜蛋白Ⅲ的Ｎ端．此噬菌体抗体库的容量为５×１０５．筛选抗ＨＩＶ－１同时又具有能被抗独特型抗体“ＩＦ７”所识别的独特型的阳性抗体：以重组包膜糖蛋白ｇｐ１６０及ｇｐ４１多肽对噬菌体抗体文库进行三次淘选,使抗ｇｐ１６０的特异性抗体得到１００倍的富集．然后通过直接ＥＬＩＳＡ和竞争性ＥＬＩＳＡ实验筛选出两株结合性较好的特异性抗ｇｐ１６０抗体－３Ｂ株与１Ｄ株．直接ＥＬＩＳＡ实验表明这两株克隆均能被“１Ｆ７”所识别,为抗独特型多肽的筛选奠定了基础．     

噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术用ＰＣＲ扩增出抗体的全套可变区基因,通过噬菌体表面表达技术,把Ｆａｂ段或单链抗体表达在噬菌体表面,经过“吸附－洗脱－扩增”过程筛选并富集特异性抗体。     

魔竽葡苷聚糖凝胶为亲和导析载体与Sepharose 4B的比较研究

将KGM凝胶和Sepharose 4B在同样条件下活化偶联,制成Cu2 金属螯合亲和胶,亲和纯化猪血SOD,并对这两种亲和胶的层析效果帮性能进行了比较,KGM金属螯合胶对猪血SOD吸附量,纯化倍数,纯化SOD的比活力和回收率分别为53000U／ml胶,19倍,12000U/mg蛋白和94．6％,而epharose 4B亲和胶对SOD的吸附量,纯化倍数,纯化SOD的比活力和回收率分别为7992U／ml胶,11倍,10125U/mg蛋白和95．4％,两种亲和胶所纯化的SOD经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,活性染色及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）证明其均为电泳纯,KGM金属螯合胶使用六次后,其对SOD吸附量,去Cu量及SOD的回收率均无明显影响。